高低转移潜能肝癌细胞OPN、TGFβ1基因沉默位点的筛选

李天然，宋 斌，黄晓斌，卢光明，李延军

1.解放军总医院第一附属医院放射科，北京 100048； 2.解放军南京总医院医学影像科； 3.解放军第九五医院放射科

高低转移潜能肝癌细胞OPN、TGFβ1基因沉默位点的筛选

李天然1,2，宋 斌3，黄晓斌3，卢光明2，李延军2

1.解放军总医院第一附属医院放射科，北京 100048； 2.解放军南京总医院医学影像科； 3.解放军第九五医院放射科

目的 通过对高低转移潜能肝癌细胞进行骨桥蛋白(osteopontin, OPN)和转移生长因子β1(transforming growth factor β1, TGFβ1)基因沉默的位点进行筛选，筛选最佳基因沉默位点。方法 qPCR检测MHCC97-H和MHCC97-L细胞两种因子表达差异情况，对MHCC97-H TGFβ1和MHCC97-L OPN高表达组进行基因沉默，每组确定3个基因位点进行沉默，Western blotting法分析各组OPN和TGFβ1表达。qPCR定量分析各组沉默效果。结果 qPCR检测显示:与MHCC97-L细胞比较，MHCC97-H细胞中TGFβ1表达量更高，与MHCC97-H细胞比较，MHCC97-L细胞中OPN的表达量更高(P<0.05)。qPCR定量分析3个位点沉默效果显示MHCC97-L OPN siRNA 226、MHCC97-H TGFβ1 siRNA 1382沉默效果较好(P<0.05)。MHCC97-L OPN不同位点沉默效果电泳图结果显示所有沉默组MHCC97-L细胞中OPN蛋白已降到非常低水平，而MHCC97-H TGFβ1不同位点沉默效果电泳图结果显示TGFβ1沉默效果1382位点明显。结论 不同的基因位点沉默效果存在差异，MHCC97-L OPN siRNA 226和MHCC97-H TGFβ1 siRNA 1382位点沉默效果最佳。通过确定最佳沉默效能的基因位点，可以达到基因最佳沉默效能为后续实验提供研究基础。

肝癌；转移；骨桥蛋白；转移生长因子β1；基因沉默

基因工程技术为开展肿瘤在基因水平的研究提供了手段[1]，具有高低转移潜能特点的肝癌细胞是研究肝癌转移行为的最佳模型[2]，通过基因工程技术修饰高低转移潜能肝癌细胞中转移相关基因和增殖相关基因，使之低表达或高表达，观察细胞转移行为和增殖行为的变化情况，为寻找合适的干预治疗提供线索。本课题组注意到骨桥蛋白(osteopontin, OPN)主要与肿瘤的转移行为有关，转移生长因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)主要与肿瘤的增殖行为有关[3-4]，为进一步探讨两种生物因子在肝癌转移行为和增殖行为中的作用，拟对具有高低转移潜能肝癌细胞进行OPN和TGFβ1基因沉默，使之低表达OPN和TGFβ1因子，观察肝癌细胞转移行为和增殖行为的变化。然而，不同的沉默基因位点沉默效果差距较大[5]，因此，基因的沉默效果需要通过实验进行验证。本研究对高低转移潜能肝癌细胞进行 OPN和TGFβ1基因沉默的位点进行筛选，为下一步研究做好前期工作基础。

1 材料与方法

1.1 实验细胞及分组实验用细胞系高低转移潜能肝癌细胞(MHCC97-H和MHCC97-L)由上海复旦大学肝癌研究所提供。两组基因沉默基因位点沉默前qPCR检测MHCC97-H和MHCC97-L细胞的两种因子表达差异情况，根据结果显示MHCC97-H高表达TGFβ1，MHCC97-L高表达OPN，因此，仅需对高表达组进行相应的沉默，根据预实验初步筛选的结果设计分组(见表1)。

表1 高低转移潜能肝癌细胞OPN、TGFβ1基因沉默实验分组

Tab 1 Experimental groups of TGFβ1 and OPN gene silencing in hepatocellular carcinoma cells with high and low metastatic potential

注：数值表示沉默位点信息。

1.2 实验材料高纯总RNA快速提取试剂盒购自Generay公司(货号：#GK3012)；逆转录试剂盒RevertAid First strand cDNA Synthesis Kit购自Thermo Scientific Fisher公司(货号：#K1622)；qPCR试剂SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)购自天根公司(货号：#FP205-02)。PVDF膜购自Millipore公司；彩色预染蛋白分子量标准购自Fermentas公司；ECL Plus发光试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)、Western及IP细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司；Tris-Hcl/SDS(1.5 mmol/L，pH=8.8)购自上海生工生物工程有限公司。

1.3 实验仪器OD值测量仪器(高精度分光光度计)为Merinton SMA4000；定量PCR仪为CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析软件为BIO-RAD CFX Manager；酶标仪：SPECTRA max Plus 384，Molecular Devices公司；电泳系统：Mini-Proten Tetra System，Bio-RAD公司；凝胶成像仪：ChemiDoc XRS+ System，Bio-RAD公司。

1.4 实验方法

1.4.1 qPCR分析MHCC97-H和MHCC97-L细胞OPN和TGFβ1表达差异实验：实验步骤：(1)Trizol-离心柱法提取细胞总RNA：收集约106个细胞，裂解，11 000 r/min,4 ℃离心10 min；(2)RNA纯度的测定和RNA的定量：以相应溶剂为对照，取2 μl RNA溶液于Merinton SMA4000检测，观察A260/A280、A260/A230比值及连续波长吸收峰，并计算RNA溶液浓度，判断RNA提取质量；(3)逆转录；(4)荧光定量PCR扩增(见表2)。

表2 OPN和TGFβ1基因沉默引物序列

Tab 2 OPN and TGFβ1 gene silencing primer sequences

基因名称引物(5'-3')homoActinForwardAGCGAGCATCCCCCAAAGTThomoActinReverseGGGCACGAAGGCTCATCATThomoOPNFAGGAGGAGGCAGAGCACAhomoOPNRCTGGTATGGCACAGGTGATGhomoTGFβ1FGGCGATACCTCAGCAACCGhomoTGFβ1RCTAAGGCGAAAGCCCTCAAT

1.4.2 高低转移潜能肝癌细胞基因序列的筛选：根据MHCC97-H和MHCC97-L细胞表达OPN和TGFβ1差异结果，仅高表达组需进行沉默，对MHCC97-H细胞中TGFβ1进行基因沉默，对MHCC97-L细胞中OPN进行基因沉默，每组根据预实验结果确定3个基因位点进行沉默，qPCR分析沉默效果(方法同1.4.1)。

1.4.3 高低转移潜能肝癌细胞OPN及TGFβ1表达Western blotting实验：实验步骤：蛋白样品制备：组织匀浆，裂解，台式离心机，11 000 r/min,4 ℃离心10 min。BCA法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭， 孵育一抗， 洗膜， 孵育二抗，洗膜， ECL化学发光显影。GAPDH作为参照基因。

2 结果

2.1 高低转移潜能肝癌细胞MHCC97-H和MHCC97-L OPN、TGFβ1表达差异分析采用2-△△Ct作为计算结果，以β-action作为内参照基因，以空白对照组(CK)作为对照基因进行标准化后相对定量结果如下。检测结果显示，MHCC97-H细胞中TGFβ1表达量更高，MHCC97-L细胞中OPN的表达量更高，差异有统计学意义(P<0.05，见图1)。

2.2 TGFβ1和OPN siRNA沉默序列筛选根据上述两个基因表达差异选择MHCC97-L细胞筛选OPN沉默序列，MHCC97-H细胞筛选TGFβ1沉默序列。每个基因合成3个不同位点的沉默序列备选。采用2-△△Ct作为计算结果，以β-action作为内参照基因，以空白对照组(CK)作为对照基因进行标准化后相对定量结果如下。

注：与MHCC97-L相比，*P<0.05。

结果显示，3个沉默序列均有沉默效果，其中MHCC97-L OPN siRNA 226、MHCC97-H TGFβ1 siRNA 1382沉默效果较好，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 不同位点OPN、TGFβ1 siRNA效果比较(2-△△Ct)

Tab 3 Comparison of OPN,TGFβ1 siRNA at different sites(2-△△Ct)

注：与空白对照组比较，※P<0.05。

2.3 Western blotting检测结果结果显示OPN沉默效果比较明显，所有沉默组MHCC97-L细胞中OPN蛋白已降到非常低水平(见图2)。TGFβ1沉默效果1382位点明显，与空白对照组比较，TGFβ1蛋白表达有所降低(见图3)。

图2 MHCC97-L OPN不同位点沉默效果电泳图

Fig 2 The effect of MHCC97-L OPN silence with different gene sites in electrophoresis

图3 MHCC97-H TGFβ1不同位点沉默效果电泳图

Fig 3 The effect of MHCC97-H TGFβ1 silence with different gene sites in electrophoresis

3 讨论

OPN是与转移相关的生物因子，通过与整合素αvβ3相结合而促进肿瘤的转移，OPN可通过改变细胞骨架引发细胞运动，促进新生血管生成，促进细胞黏附、阻止细胞凋亡等。前期本课题组研究表明，外源性OPN通过抑制MHCC97-H细胞释放内源性OPN而发挥促进肿瘤侵袭的作用，主要通过激活MMP-2因子发挥作用[6]。另外，前期研究还发现，TGFβ1与肿瘤的增殖行为有关，在高低转移潜能肝癌细胞亦存在差异[7]。因此本研究选择沉默这两个基因，然而，为选择最佳的基因沉默效果，需要对沉默基因的效能进行筛选，为下一步观察经OPN、TGFβ1沉默的具有高低转移潜能的肝癌细胞转移潜能的变化做前期研究工作。

基因在染色体上占有的特定位置叫基因位点，同一基因具有不同的位点。结果显示不同基因位点沉默效果存在差异，将OPN、TGFβ1基因表达最低的位点序列作为最后沉默的基因位点，构建该位点的沉默基因序列和载体，作为后续实验的位点标准。本研究筛选方法采用PCR方法和Western blotting，两者结果相关表明沉默该位点基因比较成功，可以进行后续实验。

RNA沉默技术是转录后水平的基因沉默机制，具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA。林帆等[8]通过OPN的RNA沉默明显抑制了肝癌细胞的生长，Saito等[9]通过体内外实验发现在体外OPN siRNA可有效沉默外源和内源性OPN表达。张志梅[10]发现TGFβ1 siRNA可以部分逆转人肝癌细胞株HepG2对顺铂的耐药性。Xu等[11]通过TGFβ1 siRNA可以延缓肝脏纤维化的进程，主要是通过降低炎症因子TNF-α、IL-1的表达水平，从而达到抑制肝脏纤维化的目的。

本研究结果显示，不同的基因位点沉默效果存在差异，MHCC97-L OPN 226和MHCC97-H TGFβ1 1 382 位点沉默效果最好。因此，通过确定最佳沉默效能的基因位点，可以达到目的基因最佳沉默效能为后续实验提供研究基础。通过基因工程技术对肿瘤细胞进行修饰，使之降低表达转移和增殖相关因子，为寻找新的治疗靶点提供依据。

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(责任编辑：马 军)

Screening of OPN and TGFβ1 gene silencing sites in hepatocellular carcinoma cells with high and low metastatic potential

LI Tianran1,2, SONG Bin3, HUANG Xiaobin3, LU Guangming2, LI Yanjun2

1.Department of Radiology, the First Affiliated Hospital of Chinese PLA General Hospital, Beijing 100048; 2.Department of Radiology, Chinese PLA Nanjing General Hospital; 3.Department of Radiology, Chinese PLA 95th Hospital, China

Objective To screen out the best OPN and TGFβ1 gene silencing sites in the high and low metastatic potential hepatocellular carcinoma cells.Methods Expression differences of MHCC97-H and MHCC97-L cells were tested by qPCR method. MHCC97-H TGFβ1 and MHCC97-L OPN gene silencing were carried out, and each group identified three sites for silencing. The OPN and TGFβ1 expressions were tested by Western blotting. The silence effect of each group was tested by qPCR quantitative method.Results qPCR detection showed that the expression of TGFβ1 was higher in MHCC97-H cells than in MHCC97-L cells, and the expression of OPN was higher in MHCC97-H cells than that in MHCC97-L cells (P<0.05). qPCR quantitative analysis of the 3 sites silencing effect showed that the MHCC97-L OPN siRNA 226 and MHCC97-H TGFβ1 siRNA 1382 silencing effect were better than other silencing sites (P<0.05). MHCC97-L OPN in different silencing sites effect electrophoresis results showed that all silent groups MHCC97-L OPN protein expression had been reduced to a very low level, and MHCC97-H TGFβ1 silence effect electrophoresis results showed TGFβ1 1382 silencing site effect was obvious.Conclusion The silencing effects of different gene sites are different, and the silencing effect of MHCC97-L OPN siRNA 226 and MHCC97-H TGFβ1 siRNA 1382 are the best. By determining the best silencing efficacy of different gene sites, it can provide the basis for the follow-up experiment.

Hepatocellular carcinoma; Metastasis; Osteopontin; Transforming growth factor β1; Gene silence

国家自然科学基金资助项目(81271607)；南京军区医药卫生重点项目资助(11Z035)；国家博士后基金(2015M572810)

李天然，博士，副主任医师，研究方向：肝癌转移潜能的研究。E-mail: lizhaoruixin@sina.com

宋斌，主任医师，研究方向：医学影像信息化系统。E-mail: ltranmd@yeah.net

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.01.019

R735.7

A

1006-5709(2017)01-0070-04

2016-02-29