非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对O型口蹄疫病毒的佐剂效果

孙小涵，张碧成，张强，何孔旺，张雪寒

（1江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室， 南京210014；2吉林农业大学动物科学技术学院， 长春130118）

非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对O型口蹄疫病毒的佐剂效果

孙小涵1,2，张碧成1，张强1,2，何孔旺1，张雪寒1

（1江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室， 南京210014；2吉林农业大学动物科学技术学院， 长春130118）

【目的】口蹄疫（foot and mouth disease, FMD）的传染性强，传播广，给世界经济和社会发展带来巨大危害，目前疫苗接种仍是主要而有效的防控手段。以增强口蹄疫疫苗免疫效力为目的，基于国内外对鞭毛蛋白佐剂的深入了解与研究，对非致病性大肠杆菌鞭毛进行修饰，研究鞭毛蛋白（flagellin, F）以及有无LTMT佐剂不同重组鞭毛蛋白对口蹄疫病毒(foot and mouth disease virse, FMDV)的佐剂作用。【方法】通过体外表达获得 pCold-F0、pCold-F0-LTMT、pCold-F0NC、pCold-F0NC-LTMT 4种不同重组鞭毛蛋白，用间接ELISA方法检测pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT蛋白的生物学活性，按照5 μg/只小鼠蛋白量与FMDV灭活抗原混合制备疫苗，同时设置添加或者不添加ISA 206佐剂组，皮下接种Balb/c小鼠，共免疫2次，每次间隔2周。分别于免疫前和免疫后 14、21、28、35和45 d采血并采集小鼠粪便，45 d后取小肠后段，采用阻断ELISA方法检测血清IgG抗体滴度，用间接ELISA方法检测小鼠粪便和肠洗液中特异的分泌性IgA（secretory IgA, SIgA）抗体滴度，以评估免疫效力。【结果】SDS-PAGE 和 Western blot分析表明，4种不同重组鞭毛蛋白成功表达。并用GM l-ELISA方法验证了pCold-F0-LTMT和pCold-F0NC-LTMT的生物学活性，融合蛋白F0-LTMT和F0NC-LTMT保留了与GM l结合能力。动物试验结果表明，疫苗经皮下注射接种后，单独口蹄疫抗原组没有产生明显的抗体水平，而鞭毛蛋白佐剂组比单独的口蹄疫抗原组，IgG滴度高，并且产生sIgA抗体滴度更早、更高。此外，LTMT与鞭毛蛋白协同作用能刺激小鼠机体产生更高的IgG和sIgA。在试验中，当鞭毛蛋白与ISA 206佐剂联合使用时，血清中IgG滴度大幅增高，且抗体持续期延长。口蹄疫抗原与ISA 206佐剂和F0NC-LTMT混合使用效果最佳，显示对FMDV的最好保护。【结论】数据表明，黏膜佐剂F0-LTMT发挥双重佐剂活性，皮下注射可显著提高FMDV全身特异性IgG和局部sIgA水平，显示其具有良好的应用前景。

口蹄疫病毒；非致病性大肠杆菌；鞭毛蛋白；佐剂

0 引言

【研究意义】现在已知致病菌来源的鞭毛蛋白具有免疫佐剂效果[1-2]，但是因其来源于致病菌，可能具有潜在的危险性，致病菌的鞭毛与肠上皮细胞基底外侧表达的TLR 5接触，可诱导NF-κB途径介导的促炎反应，产生大量针对鞭毛自身的免疫反应，导致可能的耐受性。而共生菌的鞭毛蛋白只与肠上皮细胞顶部接触，不诱导明显的促炎反应，而且具有良好的佐剂活性[3]。本研究以口蹄疫病毒 (foot and mouth disease virus，FMDV)为评估对象，研究非致病性大肠杆菌鞭毛的免疫增强能力。【前人研究进展】鞭毛蛋白作为TLR-5受体激动剂，能够诱导强烈的、广泛的免疫反应[4]。鞭毛蛋白是细菌鞭毛的单体亚基，具有高度保守的N端和C端，中间有一个高变区。鞭毛蛋白的免疫调节作用是通过TLR-5受体识别保守的N端和C端[5]。鞭毛蛋白佐剂效果先前已在许多疫苗中确定，包括流感病毒[6-7]、结核分枝杆菌[8]和鼠疫菌[9]，报告表明鞭毛蛋白是优良的载体和佐剂。MCSORLEY等[10]以鞭毛蛋白作为卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）的佐剂免疫小鼠，发现CD4+T 细胞对OVA肽段 (322—339) 的反应提高了3—10倍。PINO等[11]用FljB联合抗原共同免疫和抗原单独滴鼻免疫小鼠，前者产生更高水平的黏膜反应和全身性免疫应答，并且显示出更强烈的CD4+T细胞应答。而SUN[12]等用非致病性大肠杆菌与引发龋齿的变形链球菌的PAc蛋白融合表达时，鼻腔免疫8.5 μg融合蛋白能够降低大鼠64.2%龋齿率。YANG等[13]用HIV-1 p24抗原取代非致病大肠杆菌主要的抗原性区域D2和D3域，使非致病性大肠杆菌鞭毛与HIV-1 p24嵌合表达时，小鼠IgA滴度仍然保持较高水平，而炎症反应明显减弱，这大大增大了重组抗原安全使用的剂量范围。【本研究切入点】针对当前口蹄疫疫苗免疫后抗体产生慢、抗体水平低、抗体持续期短的缺点[14]，尝试研制一种新型黏膜免疫佐剂。本研究以一种来源于正常共生菌株的鞭毛蛋白主体，构建多个重组形式的鞭毛蛋白，与FMDV灭活抗原制备疫苗，皮下接种Balb/c小鼠，检测小鼠血清IgG、粪便和小肠 IgA抗体，评估免疫效力。【拟解决的关键问题】旨在制备非致病性大肠杆菌重组鞭毛蛋白，评估对其对FMDV的免疫增强作用。同时比较鞭毛蛋白与LTMT共同使用对FMDV灭活疫苗的佐剂作用。

1 材料与方法

试验于2015年7月至2016年7月在江苏省农业科学院兽医研究所完成。

1.1 菌株和质粒

大肠杆菌K-12 MG1655菌株、pUC57-LTMT（用于表达大肠杆菌LTB亚单位）、pCold I载体均为农业部兽用生物制品工程技术重点实验室保存。大肠杆菌感受态细胞Trans5α和BL21(DE3)，购自TransGen公司。

1.2 主要试剂

限制性核酸内切酶 XbaⅠ、EcoR I 、SalⅠ、T4 DNA ligase连接酶购自Takara公司；蛋白纯化试剂盒购自GE公司；HRP-羊抗兔-IgG购自南京诺唯赞生物科技有限公司；GM1 购自Sigma公司；HRP标记的羊抗鼠IgA抗体、兔源抗CTB抗体购自Abcam公司；口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.3 实验动物

6—8周龄Balb/c小鼠，购于扬州大学医学院。

1.4 原核表达载体的构建

1.4.1 引物设计与合成 以大肠杆菌K-12 MG1655菌株（Genbank登录号：NC_000913.3）为模板，Premier 5.0软件设计引物，引物序列见表1（下划线为酶切位点EcoR I和Sal I）。

表1 本文所用引物Table 1 Primers used in this study

1.4.2 构建重组质粒 以大肠杆菌K-12 MG1655菌株为模板，扩增F0和F0NC，再将目的基因F0和F0NC分别插入到表达载体 pCold-His相应的酶切位点中；同时将实验室保存的克隆质粒pUC57-LTMT，插入到表达载体pCold-his-F0和pCold-his-F0NC，构建重组质粒pCold-his-F0-LTMT和pCold-his-F0NC-LTMT。

1.5 重组融合蛋白的表达和纯化

1.5.1 重组蛋白的表达 将阳性重组质粒pCold-his-F0-LTMT和pCold-his-F0NC-LTMT转化BL21(DE3)感受态，挑取单菌落37℃继续快速培养至OD600=0.4—0.6，加IPTG至终浓度1 mmol·L-1（同时设对照组），16℃进行过夜诱导表达；SDS-PAGE鉴定重组蛋白是否表达，并分析其可溶性。

1.5.2 重组蛋白纯化和Western blot分析 过夜诱导重组菌，参照GE公司His TrapTMHP说明书纯化重组蛋白。SDS-PAGE检测纯化效果，同时用兔抗大肠杆菌鞭毛抗血清对纯化后蛋白进行Western blot分析。RC DC Protein Assay测定纯化蛋白的浓度，并用内毒素除去柱Detoxi-GelTM去内毒素，凝胶法鲎试剂检测内毒素含量，按使用说明书进行。

1.6 GM1-酶联免疫吸附（ELISA）

每100 μL含神经节苷脂GM1 2 μg包被96酶联板，4℃ 过夜；洗板，用2%的BSA，200 μL，37℃封闭2 h；洗板，每孔加入含12.5 ng的纯化的蛋白有LTMT的，同时设阴阳性对照；PBST洗涤，加入兔源抗CTB，1﹕1 000，37℃，2 h；PBST洗涤，加入HRP-羊抗兔-IgG 1﹕10 000，37℃，1 h；洗涤后加入TMB显色。终止液，测OD450。

1.7 免疫接种

将6周龄的Balb/c小鼠随机分成7组，5只/组，按照5 μg/只小鼠蛋白量与FMDV灭活抗原混合制备疫苗，后以1﹕1的比例添加ISA 206佐剂，具体分组和免疫剂量（表2）。共免疫2次，间隔2周。分别于免疫前和免疫后14、21、28、35和45 d小鼠眼眶静脉丛采血并采集小鼠粪便，45 d小鼠处死，取小肠后段，测定不同免疫时期小鼠的抗体水平。

表2 小鼠免疫试验Table 2 Mice immunization

1.8 小鼠血清抗体水平的检测

1.8.1 免疫小鼠粪便特异性 sIgA测定 采用间接ELISA方法进行：每0.1 g粪便加入0.5 mL粪便提取液，4℃浸润。12 000 r/min 离心10 min，收集上清。以重组VP1蛋白做为抗原包被ELISA反应板（0.08 μg/孔），4℃包被过夜；用5%脱脂乳封闭，洗板；按一定的倍数稀释待检样品（同时设阴性对照），37℃反应1 h；二抗是HRP标记羊抗鼠 IgA，37℃反应1 h，显色终止。酶标测定仪在波长450 nm处测定每孔的光吸收值。

1.8.2 免疫小鼠血清中特异性 IgG检测 用口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体检测试剂盒进行检测：分别于免疫前和免疫后14、21、28、35和45 d采集小鼠血液，分离血清，检测方法参照说明书。

1.8.3 免疫小鼠肠道中sIgA检测 间接ELISA方法进行检测：在免疫45 d处死小鼠，采集小肠后段5 cm，加入0.5 mL肠道冲洗液处理，12 000 r/min离心10 min，收集上清。测定方法同1.8.1。

2 结果

2.1 重组菌构建、蛋白表达和纯化

经双酶切鉴定，均获得大小预期片段，为阳性重组质粒（图 1）。SDS-PAGE显示，重组蛋白以可溶形式存在于细菌裂解上清中，F0、F0NC、F0-LTMT、F0NC-LTMT蛋白大小分别为55、41、79和61 kD。经His TrapTMHP纯化后，得到高浓度和高纯度的4种重组蛋白（图2），通过检测内毒素含量均小于0.5 EU·mL-1。

图1 重组质粒双酶切反应鉴定图Fig. 1 Restriction enzyme of recombinant plasmids

图2 纯化产物的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE patterns of purified product

2.2 Western blot 分析

纯化的蛋白SDS-PAGE电泳后，转印至硝酸纤维素膜上，以兔抗大肠杆菌鞭毛抗血清为一抗，HRP 标记的羊抗兔IgG抗体为二抗，显色后出现清晰且特异的目的条带（图3）。

2.3 生物学活性检测

LTMT的免疫增强是由于其形成的五聚体有与GM l结合能力，在热变性下，使五聚体解聚后丧失与GM l结合能力。因此，鉴定融合蛋白 F0-LTMT和 F0NCLTMT是否能形成五聚体，保留与GM l结合能力是很必要的。GM l-ELISA分析表明，融合蛋白F0-LTMT和F0NC-LTMT保留了大部分与GM l结合能力。而单纯的载体蛋白H0与GM 1基本无结合能力（图4）。

图3 表达产物Western-blot 分析Fig. 3 The Western-blot analysis of the expression product

图4 融合蛋白F0-LTMT和F0NC-LTMT生物学活性检测Fig. 4 Test results of biological activity of fusion protein F0-LTMT and F0NC-LTMT

2.4 Balb/C小鼠的免疫效果

2.4.1 免疫小鼠中粪便特异性 sIgA测定 分别于免疫前和免疫后14、21、28、35和45 d采集小鼠粪便，检测sIgA水平。图 5所示，1组（灭活口蹄疫病毒组）和2组（206+灭活口蹄疫病毒组）没有sIgA抗体产生，而含有鞭毛蛋白免疫组小鼠产生明显特异性sIgA抗体。4组（F0+灭活口蹄疫病毒组）在28 d达到最高，1﹕50；5组（F0NC+灭活口蹄疫病毒组），F0截掉高变区后，IgA抗体滴度是 5组一半，为 F蛋白组中抗体水平最低的。6组（F0-LTMT+灭活口蹄疫病毒组）和7组（F0NC-LTMT+灭活口蹄疫病毒组）比4组抗体水平高，7组是所有组最好，为1﹕55，高于无F蛋白的1组和2组约50个滴度单位，差异极显著（P＜0.001），比3组和4组抗体水平高约25个滴度单位，比6组高约15个滴度单位，在45 d后，F蛋白3、4、5、6、7组仍可以检测到相应的sIgA抗体。

2.4.2 免疫小鼠血清中特异性 IgG测定 分别于免疫后14、21、28、35和45 d采集小鼠血液，收集血清检测IgG水平。经2次免疫在21 d各组小鼠产生了较高的抗体水平，除1组外，其他各组均达到完全保护（26）。在28 d F蛋白+灭活口蹄疫病毒免疫组中6组产生抗体效果明显 1﹕180（27.5），其他差异不明显，大约在1﹕110（26.8）。2组抗体水平较高约1﹕240（27.9），而ISA 206佐剂和H0NC-LTMT与灭活口蹄疫病毒混合使用的效果最佳1﹕256（28），与灭活口蹄疫病毒的对照组相比较差异极显著（P＜0.001，图 6）。持续到45 d仍可以检测到较高抗体。

2.4.3 免疫小鼠肠道中sIgA检测 在免疫45 d采集小鼠肠道，检测sIgA水平，检测结果表明（图 7），不含F蛋白的1、2 组几乎检测不到 IgA 抗体，而含有F蛋白的几个免疫组在免疫鼠肠道中能够测得较高的IgA抗体。3组、5 组、4 组、6 组和7 组IgA抗体水平依次增高，7 组为最高可达 1﹕55，高于灭活口蹄疫病毒组 1﹕10，差异极显著（P＜0.01）。

图5 免疫小鼠粪便中 IgA 水平Fig. 5 IgA level in fecal material of immunized mice

图6 免疫小鼠血清中IgG水平Fig. 6 IgG level in the serum of immunized mice

3 讨论

鞭毛蛋白作为天然免疫应答的诱导剂，能诱导产生天然免疫应答帮助外源抗原建立获得性免疫应答。鞭毛蛋白以偶联或融合形式作为创新疫苗的一个重要佐剂已被频繁报道。而根据鞭毛蛋白两端保守，中间高度变异的特点，研究者对其遗传学、免疫学等方面作深入研究，逐步建立了有效的鞭毛表达系统[15-16]。LEE等[17]用嗜盐弧菌鞭毛蛋白 FIaB作为破伤风类毒素（tetanus toxoid，TT）的佐剂，通过鼻内免疫小鼠，结果表明TT特异性sIgA明显高于对照组。HONKO等[9]将鞭毛蛋白联合鼠疫杆菌Fl蛋白皮下和鼻腔免疫小鼠，发现显著增强了F1特异性IgG抗体水平，且IgG抗体亚类倾向于Th2平衡。HULEATT[18]等通过TLR5配体鞭毛蛋白与保守的流感基质蛋白 M2外功能区的4个重复序列在大肠杆菌中融合表达，提纯后得到重组蛋白STF2.4xM2e，用其免疫小鼠，发现M2e特异性抗体水平和M2e肽与铝胶佐剂混合组相当，鼻腔免疫0.3 μg重组蛋白就能防止甲型流感病毒的致死性感染。SALMAN[19]更是将肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白与OVA制成纳米包被颗粒，发现不管是灌服还是皮下注射免疫都出现了显著而平衡的全身性免疫应答。而且给药方式也灵活多变，有皮下注射，鼻内免疫，口服接种等。虽然鞭毛蛋白的佐剂功能激活的具体机制尚未清楚阐释，但蛋白纯化不仅容易可行，而且蛋白纯度较高，给药方式灵活，并最终使机体产生特异性体液免疫、黏膜免疫和细胞免疫反应，成为新型佐剂的候选者。

图7 免疫小鼠肠道中IgA水平Fig. 7 IgA level in intestinal tract of immunized mice

口蹄疫被认为是全球引起最多经济损失的传染病[20]，其病死率虽然不是很高，但对畜牧业造成的影响巨大。目前中国预防口蹄疫的主要措施是疫苗的免疫注射，而灭活口蹄疫疫苗使用最为广泛[21-22]。单纯的口蹄疫病毒抗原的免疫原性比较低，免疫动物后不能产生有效的保护力， 需要使用佐剂提高抗原免疫原性，例如铝盐类佐剂和油乳类佐剂，铝盐类佐剂产生的抗体效价较低，并且维持免疫反应持久性上较弱[23]；油乳类佐剂也伴随一定的副反应，特别是在注射部位引起的上皮巨噬细胞颗粒化和溃疡。而细菌鞭毛蛋白作为疫苗佐剂具有以下诸多特点：通过使用极低剂量（1 —10 μg）的细菌鞭毛蛋白就可促进IgG 1和IgG 2a应答[24]，这样有可能会避免对机体产生副作用；另外，给兔滴鼻或使用两倍剂量（100—500 mg）肌肉注射，28 d后仍然没有检测到毒性；鞭毛蛋白除有自身的强免疫原性外，还具有增强外源抗原免疫原性的特性，包括体液免疫和细胞免疫。但由于鞭毛蛋白来源于致病菌，可引发促炎反应[25]。而笔者选择来自非致病性细菌鞭毛蛋白作为佐剂，是由于其具有非致病性的性质和免疫反应的特点。研究认为非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白将是一个安全而有效的佐剂。

在本研究中笔者发现鞭毛蛋白对机体的体液免疫和黏膜免疫都有一定的促进作用。IOANNA等[26]经口鼻免疫接种的鞭毛蛋白佐剂流感疫苗，能同时提高小鼠体内的IgG和IgA的水平，但研究表明鞭毛蛋白对IgG有一定的促进作用，但并不显著，这种差异可能和所用的抗原和免疫途径不同有关。而CHAUNG等[27]用鸡体研究鞭毛蛋白佐剂H5N2亚型禽流感疫苗的结果表明，经口鼻免疫接种鞭毛蛋白佐剂H5N2亚型禽流感疫苗后，鸡体内血清IgG的水平均没有显著提高。这与本研究的结果相似，表明沙门菌鞭毛蛋白佐剂作用很可能是通过提高黏液中sIgA水平来实现的。在本试验中，笔者加入广泛应用于口蹄疫疫苗的 ISA 206佐剂，显著增强了口蹄疫抗原的免疫效果，当ISA 206佐剂和H0NC-LTMT与灭活口蹄疫病毒混合免疫时，IgG抗体水平比 206+灭活口蹄疫病毒组极显著增高（图 6），说明ISA 206佐剂和H0NC-LTMT混合使用能更好的促进小鼠产生IgG抗体。而鞭毛蛋白对黏膜免疫的作用尤为明显，经皮下免疫的F蛋白与灭活口蹄疫病毒组均产生较高的IgA抗体，而无F蛋白组几乎没有IgA抗体产生。如图 5所示，F0蛋白截掉高变区后，影响了IgA抗体的产生，只有F0全长的一半，全部或部分缺失鞭毛蛋白高变区会使鞭毛的抗原性降低，但不会影响其佐剂活性[28]。而高变区容许外源蛋白插入[10-11]，为此将LTMT插入到F0和F0NC融合表达后，显著增加了IgA抗体水平，二免21 d后F0NC-LTMT蛋白效果达到最佳，同时F0和F0NC与LTMT融合表达也在一定程度上促进 IgG产生，与sIgA结果不同，F0-LTMT更能有效的促进IgG抗体产生。大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin, LT）的B亚单位为LT的结合部位，其无毒性以及良好的黏膜佐剂活性, 成为黏膜疫苗研究的一个重要佐剂[29-30]。有研究表明，小鼠黏膜免疫试验，LT能诱导混合的CD4+Th1和Th2型细胞[31]。黏膜免疫是免于机体被病原体侵犯的重要屏障，LTMT与鞭毛蛋白协同作用能刺激小鼠机体产生更高的sIgA。口蹄疫病毒可以通过口腔和呼吸道黏膜方式感染，因此，疫苗能够诱导黏膜免疫是非常重要的[32]。而针对当前O型口蹄疫疫苗免疫后抗体产生慢、抗体水平低、抗体持续期短的缺点，在本试验中14 d即可检测到IgG抗体水平，28 d各组达到完全保护，达到最高，而且到45 d仍然可以检测到较高的抗体水平，达到完全保护。说明鞭毛蛋白对机体的体液免疫和黏膜免疫都有一定的促进作用，对口蹄疫抗原具有佐剂作用。

4 结论

口蹄疫病毒与较低剂量鞭毛蛋白皮下免疫确实能够刺激小鼠机体产生局部黏膜免疫应答和一定的全身体液免疫应答，非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白具有作为灭活口蹄疫疫苗佐剂的潜力。

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（责任编辑 林鉴非）

Adjuvant Effects of Flagellin from Non-Pathogenic E.coli on FMDV

SUN XiaoHan1,2, ZHANG BiCheng1, ZHANG Qiang1,2, HE KongWang1, ZHANG XueHan1
(1Institute of Veterinary Research, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Engineering Research of Veterinary Bio-products of Ministry Agriculture, Nanjing 210014;2College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Jilin 130118)

【Objective】Foot and mouth disease (FMD) is highly infections and spread wide. It has brought a great harm to the world economic and social development. The current vaccination is still the main and effective means of prevention and control of this disease. To enhance FMD Virus (FMDV) antigenicity, the Flagella (F0) was modified from the non-pathogenic Escherichia coli to construct recombinant F0 protein and evaluate the single F0 protein and fusion protein F0-LTMT adjuvant effectiveness on FMDV based on the research about flagella protein adjuvants from home and abroad.【Method】Four recombinant proteins of F0, F0-LTMT, F0NC, and F0NC-LTMT were expressed, and their biological activities were detected by GM1-ELISA. The FMDV immunogen was prepared by mixing inactivated FMDV with a single recombinant F0 at 5 μg per mouse, and additional ISA 206 adjuvant was setaccording to the proportion to evaluate the immune effect in mice. The Balb/c mice was subcutaneously inoculated with emulsified immunogen twice at intervals of 2 weeks. Sera and feces were collected, respectively, on the day 0, 14, 21, 28, 35 and 45, and distal intestine was also collected after immunization on day 45. Titers of IgG in serum were detected by blocking ELISA kit, specific sIgA in feces and intestinal liquid by indirect ELISA to evaluate the titers.【Result】SDS-PAGE and Western blot analyses showed that four different recombinant flagellin were successfully obtained. Their biological activities were verified by GM l-ELISA. In mice no significant levels of antibodies were detected in the single FMDV immunized group compared with higher IgG titer sIgA titers in flagellin adjuvant group. Moreover, the synergistic effect of LTMT and flagellin facilitated to produce more IgG and sIgA in mice. When flagellin combined with the ISA 206 adjuvant, the titer of serum IgG increased significantly and gave extended duration. The mixed immunogen of FMDV, ISA 206 and H0NC-LTMT displayed the best antibody titers.【Conclusion】F0-LTMT provided dual adjuvant effectiveness to FMDV, induced systemic specific IgG and sIgA in mice. It is a potential mucosal adjuvant for FMDV.

FMDV; Escherichia coli; flagellin; mucosal adjuvant

2016-08-05；接受日期：2017-02-07

江苏省自主创新资金（cx（15）1060）、国家自然科学基金（31572503）

联系方式：孙小涵，Tel：18641938670；E-mail：1427670749@qq.com。通信作者张雪寒，E-mail：liuxuehan1996@hotmail.com