猪腹泻性病毒病荧光定量PCR鉴别诊断方法研究进展

■文/山东绿都生物科技有限公司 于新友 李天芝

猪腹泻性病毒病荧光定量PCR鉴别诊断方法研究进展

■文/山东绿都生物科技有限公司 于新友 李天芝

荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、快速高效、定量准确、全封闭反应等优点，越来越受到广大兽医相关工作者的关注，在动物疾病诊断中应用越来越广泛，本文综述了猪腹泻性病毒病荧光定量PCR鉴别诊断方法的研究进展情况，以期为今后猪腹泻性病毒病的诊断和防控工作提供参考。

猪腹泻性病毒病；荧光定量PCR；鉴别诊断

腹泻是当前威胁养猪业的一类重要疾病，导致猪腹泻的原因很多，包括营养性腹泻、细菌性腹泻、病毒性腹泻和寄生虫等因素。其中，病毒性因素是非常重要的一种因素，病毒性腹泻传播快、危害大、无特效药物治疗，且发生与流行在近年呈现持续上升的趋势，给养猪业造成巨大的经济损失[1]，引起猪发生腹泻的病毒主要有流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒[2]等。核酸检测技术是通过对疾病相关的核酸分子研究，了解疾病的发生、发展情况，为疾病的诊断及防控工作提供参考。随着技术的不断发展和成熟，核酸检测技术在兽医临床中的地位显得更为重要。实时荧光定量PCR是在PCR技术基础上发展起来的一种的核酸检测技术。它是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，不再需要对PCR产物进行检测，即可实现对未知模板定性检测或定量分析。因其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、快速高效、定量准确、全封闭反应、高通量等优点，在兽医临床诊断中应用越来越广泛，本文综述了猪腹泻性病毒病荧光定量PCR诊断方法的研究进展，以期为今后猪腹泻性病毒病的诊断和防控工作提供参考。

1 实时荧光定量PCR技术

1.1 荧光定量PCR技术原理

实时荧光定量PCR就是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号(阈值)时所需的循环次数，即Ct值。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

1.2 荧光定量PCR技术分类

实时荧光定量PCR包括染料法和探针法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，染料法则是利用与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加，常用的染料有SYBR GreenⅠ、SYBR Gold、Power SYBR Green等。探针法特异性好，染料法操作简便，成本低。

2 在猪腹泻性病毒病检测中的应用

2.1 猪流行性腹泻病毒诊断

猪流行性腹泻病毒(PEDV)可导致猪流行性腹泻，主要特征是呕吐、脱水和水样腹泻，多发生于冬、春季节。各日龄的猪均可感染PEDV发病，其中哺乳仔猪受到的危害最严重。董世娟等[3]建立检测PEDV的TaqMan荧光定量PCR方法，建立的定量标准曲线Ct值和模板起始拷贝数对数在108～101copies/μL有良好的线性关系，相关系数的平方为0.997，该法可检测6.368copies/μL的模板量。于长青等[4]建立了基于SYBR GreenⅠ的PEDV荧光定量PCR检测方法。结果显示，该法扩增效率为100.4%，相邻扩增曲线之间间距均匀，所有产物的熔解曲线具有单一整齐的峰，标准曲线具有优良的线性关系，最低可准确检测520拷贝/μL的模板量，重复性试验的变异系数小于3%。曹贝贝等[5]建立了检测PEDV的SYBR Green I荧光定量RTPCR方法。该法对常见的病毒均未检测到荧光信号，而仅对PEDV检测为阳性，其灵敏度为57copies/μL，组内和组间变异系数均小于1%。

2.2 猪传染性胃肠炎病毒诊断

传染性胃肠炎病毒(TGEV)可引起猪传染性胃肠炎，该病是一种以呕吐、水样腹泻、脱水为主要特征高度传染性疾病，秋始、冬春为该病高发期。各种不同品种和月龄的猪都能感染TGEV发病，2周龄受到的危害最为严重，一旦感染后，其死亡率可高达100%。5周龄以上的猪感染后虽然死亡率不高，但生长缓慢，饲料利用率低。王建中等[6]参照GenBank登录的TGEV S基因序列设计引物，通过优化反应条件，建立了检测TGEV的荧光定量PCR检测方法，结果显示，该法具有良好的特异性，对其他病原的检测结果为阴性，其检测敏感性可达43.07copies/μL，是普通RT-PCR检测方法的100倍。方振华等[7]将TGEV N基因部分片段克隆并连接到pGEM-T Easy载体上，得到重组质粒，以此为标准模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增并制作标准曲线，建立TGEV的荧光定量RT-PCR检测方法。该法检测灵敏度可达10copies/μL，具有良好的特异性和重复性。李继良等[8]根据TGEV的N基因设计引物，建立了基于SYBR GreenⅠ的TGEV荧光定量PCR检测方法，该法的扩增效率为101%，标准曲线的决定系数为0.9997，可准确检测的最低核酸模板浓度为490copies/μL，重复性试验的变异系数小于3%。

2.3 猪轮状病毒诊断

猪轮状病毒(PoRV)可引起猪的腹泻，1～4周龄仔猪最易感，发病率在80%以上，死亡率为7%～20%，育成猪和成年猪通常为隐性感染[9]。主要临床表现为厌食、呕吐、水样腹泻，导致仔猪严重脱水和酸碱平衡紊乱，继发细菌性感染后，病死率升高。陈小金等[10]根据GenBank中登录的A群猪轮状病毒(PoRV)毒株序列，针对VP7基因设计了1对特异性引物，建立了检测A群PoRV的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法，结果显示，该法1.3×108～1.3×102copies/ μL范围内线性关系良好，相关系数的平方为0.999，最低检测限为1.3×101copies/μL，对猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）核酸检测结果为阴性，批内及批间变异系数均低于2%。高婉俊等[11]建立了检测G9型Po RV的Taq Man荧光定量RT-PCR检测方法，结果显示，该法的相关系数的平方为0.991，对其他常见的Po RV(G5)、TGEV、PEDV、PRRSV和猪圆环病毒2型(PCV2)等猪病原检测均阴性，具有良好的特异性，最低可以检测到的病毒滴度为103TCID50，比普通RT-PCR方法灵敏度高约1,000倍，组内和组间变异系数均小于0.87%，稳定性高，重复性好。

2.4 猪伪狂犬病毒诊断

猪伪狂犬病毒(PRV)不但能引起母猪繁殖障碍（如流产、产木乃伊胎、死胎和产弱仔），还可引起仔猪的拒食、呕吐、腹泻、呼吸困难、口吐白沫，有共济失调、转圈和抽搐等神经症状，感染率和死亡率可达100%。田青等[12]根据PRVg B基因保守序列，设计引物和Taq Man探针，建立了检测PRV的荧光定量PCR方法。该法可检测到相当于10copies/μL的病毒DNA，比常规PCR检测方法高约100倍，敏感性较强，该方法检验CSFV、PRRSV和PCV2呈现阴性结果，特异性强，变异系数小于1%，具有良好的重复性。 张志等[13]针对PRV疫苗株基因组缺失的3.5kb片段，设计3套引物和探针，建立了一种新的快速鉴别PRV野毒株和疫苗株的实时荧光定量PCR方法。该法的检测极限可达10copies/μL，并与CSFV、PRRSV、PPV和PCV2等不存在交叉反应现象，批内和批间重复性试验的变异系数分别（1.70±1.07）%和（2.22±1.02）%，重复性好。陈如敬等[14]根据PRV gE基因序列，设计引物，建立基于SYBR GreenⅠ染料的PRV实时荧光定量PCR检测方法。结果表明，该法检测猪PRV gE基因在7.53×10-1～7.53×10-6copies/ μL线性关系较好，从生成的熔解曲线可见，建立的方法仅对猪PRV检测出现单一特异峰，其熔解温度(Tm值)为(92.9±0.1)℃，PCV2、PPV、副猪嗜血杆菌和猪链球菌均未见特异性峰值，该法组内和组间变异系数分别为0.31%～1.14%和0.42%～1.74%。

2.5 猪瘟病毒诊断

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪急性、热性、高度接触性传染病。不同年龄、性别、品种的猪均易感，一年四季均可发生。根据临床表现可分为急性型猪瘟、慢性型猪瘟、非典型性猪瘟和迟发型猪瘟，急性型与慢性型猪瘟均有腹泻的临床表现，主要为急性型猪瘟病初便秘，随后出现糊状或水样并混有血液的腹泻，大便恶臭。慢性型猪瘟食欲时好时坏，便秘和腹泻交替发生。谢金文等[15]建立了能鉴别CSFV强毒感染与弱毒疫苗的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法，其Tm值分别为84.5±0.5℃和88.5±0.5℃，该法特异性强，对其他相关病毒无特异性扩增，敏感性高，最低检出量为5×RID50的细胞毒基因组拷贝，重复性好，并且扩增效率高、线性范围广、检测时间短。岳锋等[16]根据GenBank中CSFV 5'NTR的保守序列，设计1对特异性引物和TaqMan探针，以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品，建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线，进行特异性、敏感性和重复性试验。结果表明，标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系，相关系数的平方为0.999，敏感性高，最低检测限为1×101copies/μL，特异性强，与PCV2、PPV、PRV和PRRSV无交叉反应性，重复性好，组内和组间变异系数均小于2%。杜冬华等[17]根据CSFV野毒株和疫苗株E2基因序列差异，建立了能同时检测CSFV野毒株和疫苗株的双重Taq Man real-time PCR鉴别检测方法。结果表明，建立的CSFV双重Taq Man real-time PCR标准曲线Ct值与1×101～1×106copies/μL之间的E2基因拷贝数呈良好的线性关系，灵敏度达10copies/μL，且特异性和重复性很好。

2.6 猪圆环病毒2型诊断

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪猪断奶后多系统衰竭综合征、母猪繁殖障碍、断奶猪和育肥猪呼吸道疾病、猪皮炎肾病综合征、猪腹泻综合征以及仔猪的中枢系统疾病等多种疾病。其中引起的猪腹泻综合征主要表现为腹泻与正常排便交替出现，用药效果不明显，反复迁延。郭慧娟等[18]建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示，该法与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪流感病毒、PRRSV、PRV、CSFV等均无交叉反应，最低可检测4.53×102copies/μL的模板量，比PCR检测方法高100倍，其标准曲线线性范围是102～109copies/ μL，重复性好。于新友等[19]采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242bp片段，并克隆入pMD18-T载体中，以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增，建立了PCV2荧光定量PCR检测方法，该方法检测灵敏度可达1.2×10-1copies/μL，与PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV、乙型脑炎病毒(JEV)核酸均不发生扩增反应，具有很好的特异性和重复性。郝立沙等[20]根据GenBank中PCV2保守序列，设计1对特异性引物和Taq Man探针，制备标准品，建立PCV2的荧光定量检测方法。结果表明：该方法在1×101～1×108copies/μL的模板范围内具有良好的线性关系，相关系数可达0.999，敏感性是常规PCR方法的100倍，对PPV、PRV、CSFV、PRRSV均为阴性，没有交叉反应，批内、批间重复试验变异系数均小于2.50%，在临床检测中，比常规PCR方法检测PCV2的阳性检出率高出38%。

2.7 PRRSV诊断

PRRSV可引起猪繁殖与呼吸综合征，各日龄猪均可感染，母猪主要表现为繁殖障碍，母猪流产率可达30%以上，仔猪可表现为呼吸困难、腹泻等，仔猪腹泻多发生于出生2d以后，糊状下痢，有的排出灰色或黑色焦油状稀便，部分便中带血，发病率50%以上，死亡率30%以上，无明显的季节性，吴海港等[21]根据PRRSV的ORF7保守序列分别设计引物和TaqMan探针，建立了基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测PRRSV的方法。该法扩增效率为97%，具有良好的线性关系。利用建立的方法检测PCV2、PPV、PRV、CSFV、JEV，结果均为阴性，特异性性好。灵敏度试验表明该方法检测极限为5copies/μL。温青娜等[22]根据欧洲型PRRSV N基因、美洲型PRRSV M基因和高致病性PRRSV nsp2基因的各自保守序列设计特异性的引物和不同荧光标记的TaqMan荧光探针，通过优化反应体系和扩增条件，建立了能够检测欧洲型、美洲型和高致病性PRRSV的多重实时荧光定量PCR方法。该方法的重复试验表明其批内和批间的变异系数最高值分别为1.84%和1.76%，灵敏性试验表明其检测下限为10copies/μL，特异性试验表明与其他一些猪源病毒无交叉反应，具有良好的特异性，临床试验表明，该方法能够快速准确地检测出临床组织样本中美洲型及高致病性PRRSV的核酸，该法还可以检测出欧洲型PRRSV目的基因。

2.8 其他病毒诊断

荧光定量PCR方法还用于猪博卡病毒[23]、猪嵴病毒[24]和猪捷申病毒[25]等多种猪腹泻相关病毒的检测，试验结果都表明荧光定量PCR是一种简便、快速、高灵敏和高特异的核酸扩增方法。

3 小结

荧光定量PCR方法作为一种快速基因扩增方法，自出现以来，受到了广泛的关注，在国内外疾病诊断、卫生、食品及环境等多个领域都取得了重大成就，在动物疾病病因的确诊方面发挥的巨大的作用，检测敏感性高，可检测潜伏期的病原，起到了对猪场疾病的预警作用，检测结果快速、准确，可及时分析猪的病因，采取合适的治疗措施，从而及时有效控制疫情，使养殖场损失降到最低。但荧光定量PCR技术同样存在一些不足，①在对模板进行定量检测时，由于各单位所用的标准品各不相同，产生的标准曲线也不同，导致实验结果会有偏差。②在对RNA模板的样品进行定量时，不用厂家的逆转录酶的效率不同，可能导致结果不一致。③由于进行封闭检测，不通过电泳检测结果，所以不能监测扩增产物的大小，尤其是用染料法检测时易出现假阳性结果。④对操作人员要求高，一旦出现问题，不能分析原因。随着分子生物学技术的不断发展，各国专家学者不断研发出新型的荧光定量PCR仪器，降低了仪器成品，开发了一些便携式荧光定量PCR，方便携带，成本低廉，并不断降低试剂的成本，提高试剂检测的敏感性，如果再制定一系列统一的检测标准，对检测人员开展相应的培训，荧光定量PCR检测方法必定在猪腹泻性病毒病的基层实验室检测和流行病学调查中发挥重要的作用。■

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山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目(SDAIT-08-17)。