E2F-1与小细胞肺癌多药耐药及预后的相关性*

金沅武，赵媛，孟祥娇

（1.山东省淄博矿业集团有限责任公司中心医院 肿瘤血液科，山东 淄博 255120；2.山东省医学科学院，山东 济南 250062）

E2F-1与小细胞肺癌多药耐药及预后的相关性*

金沅武1，赵媛1，孟祥娇2

（1.山东省淄博矿业集团有限责任公司中心医院 肿瘤血液科，山东 淄博 255120；2.山东省医学科学院，山东 济南 250062）

目的探讨E2F-1在小细胞肺癌（SCLC）多药耐药中的作用及其与预后的关系。方法检测92例SCLC患者肿瘤组织中E2F-1的表达，分析E2F-1 mRNA表达对患者生存时间的影响，培养人SCLC敏感细胞株H69和多药耐药细胞株H69AR，分为E2F-1过表达组、阴性对照组和空白对照组，检测不同转染组细胞药物敏感性。结果SCLC组织中E2F-1 mRNA相对表达量与癌旁组织比较，差异有统计学意义（P<0.05）；低表达组患者中位生存时间与高表达组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；E2F-1过表达组H69细胞对阿霉素、顺铂和依托泊苷的IC50值与阴性对照组和空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），而E2F-1干扰组H69AR细胞对阿霉素、顺铂及依托泊苷的IC50值与阴性对照组和空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论E2F-1在SCLC组织中呈高表达，下调E2F-1可增强多药耐药细胞株H69AR对化疗药物敏感性。

小细胞肺癌；E2F-1；RNA干扰；多药耐药

小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）占原发性肺癌的16%～25%[1]，临床上以全身化疗作为SCLC治疗重点，但易发生化疗耐药而影响患者预后[2]。研究表明，细胞增殖和凋亡失衡是导致肿瘤细胞发生多药耐药的重要原因[3]。E2F-1作为细胞周期相关转录因子E2F家族重要成员，是调控细胞增殖和凋亡过程的关键性启动子[4]，通过多种途径参与调控肿瘤细胞凋亡过程[5]。本研究分析SCLC患者肿瘤组织中E2F-1的表达及其与预后的关系，利用小分子RNA干扰抑制其表达，观察对SCLC多药耐药的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2006年3月-2011年3月在山东省淄博矿业集团有限责任公司中心医院诊治的SCLC患者92例。其中，男性42例，女性50例，平均年龄（53.8 ±9.7）岁。所有患者经病理学检查确诊，确诊前均未接受放化疗治疗。临床分期：61例为广泛期，31例为局限期。所有患者行依托泊苷联合顺铂化疗方案，治疗5～6个周期后完全缓解或部分缓解（化疗敏感）30例，稳定或进展（化疗耐药）62例。所有患者留取肿瘤组织及其癌旁组织保存于-70℃液氮中以备检，本研究通过医院伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 主要试剂和仪器

人SCLC敏感细胞株H69和多药耐药细胞株H69AR均购自美国ATCC公司，无血清细胞冻存培养基（roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）和胎牛血清均购自美国Gibco公司，Trizol总RNA提取试剂盒和Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒购自大连宝生生物工程有限公司，E2F-1、E2F-1干扰系列及模拟序列、阴性对照序列及内参引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，活细胞计数法试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）购自上海翊圣生物科技有限公司，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪购自美国ABI公司。

1.3 研究方法

1.3.1 细胞培养及转染 将人SCLC敏感细胞株H69和多药耐药细胞株H69AR分别用含15%胎牛血清和20%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在5%二氧化碳CO2、37℃恒温培养箱中培养。待细胞融合度达60%～70%时，将细胞接种于6孔板中，细胞密度5×105个/ml，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行转染，根据转染物不同，将人SCLC敏感细胞株H69细胞分为3组：①E2F-1过表达组。通过质粒重组、病毒包装构建E2F-1启动子溶瘤病毒Ad-E2F-1，正向引物：5'-GTTTCATCCGGACAAAGCC-3'，反向引物：5'-CTCGAGGATATCATCGAG-3'；②阴性对照组。以CMV启动子调控下的复制缺陷性腺病毒Ad-EGFP作为对照，正向引物：5'-AGCTGGACG GCGACGTAAAC-3'，反向引物：5'-CACGAACTCCAG CAGGACATG-3'；③空白对照组。不做任何处理。将多药耐药细胞株H69AR细胞分为3组：①E2F-1干扰组，转染E2F-1-siRNA正向引物：5'-TTTGCTCTT AAGGGAGATCTGAA-3'，反向引物：5'-ACUAUGGU GGCAGAGUCAGdTdT-3'；②阴性对照组，转染阴性对照组正向引物：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUT T-3'，反向引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；③空白对照组，不做任何处理。转染后培养于5% CO2、37℃恒温培养箱中。

1.3.2 qRT-PCR检测肿瘤及其癌旁组织和不同转染组细胞中E2F-1基因表达 取肿瘤及其癌旁组织，研磨后加入细胞裂解液进行裂解，取转染后培养48 h细胞，加入细胞裂解液进行裂解，用Trizol总RNA提取试剂盒对总RNA进行提取，利用分光光度计对总RNA纯度进行检测，取A260/A280≥1.80作为合格样品。用逆转录试剂盒逆转录获得模板单链cDNA，以cDNA为模板用PCR试剂盒进行PCR。E2F-1正向引物：5'-CCCAACTCCCTCTACCCT-3'，反向引物：5'-CTCCCATCTCATATCCATCCTG-3'；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）正向引物：GGGAGCCAAAG GGTCAT-3'，反向引物：5’-GAGTCCTTCCACGATAC CAA-3'。PCR反应条件：94℃预变性60 s，92℃变性30 s，56℃退火30 s，74℃延伸30 s，共36次循环。每个样品均设置3个平行反应复孔。用2-△△Ct法获得肿瘤及其癌旁组织和不同转染组细胞中E2F-1基因相对表达量。

1.3.3 CCK-8法检测不同转染组细胞的药物敏感性 取各组转染后培养24h细胞，接种于96孔板中，分别将化疗药物阿霉素、顺铂及依托泊苷加入到培养基中，进行稀释，使阿霉素浓度分别为12.5、25.0、75.0和100.0 μg/ml，顺铂分别为50、100、200、300和400 μg/ml，依托泊苷分别为100、200、400、600和800 μg/ml，分别加入到不同孔中，并设置对照孔，每个样品均设置5个反应复孔。将CCK-8加入各孔，于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养4 h，利用酶标检测仪对各孔450 nm处吸光度（A值）进行检测，计算各组细胞存活率=（不同药物浓度A值均值—空白孔A值均值）/不含药物阳性对照组A值均值，根据不同药物浓度下的细胞存活率，绘制对数曲线，获得细胞生存率为50%时的药物浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.4 随访方法 所有SCLC患者进行随访，方式包括电话及门诊复查；内容包括一般检查、临床症状及影像学检查。随访截止日期2016年3月31日，随访时间5～120个月，其中，66例患者死亡，26例患者生存，未出现失访病例。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，利用Kaplan-Meier法对SCLC组织中E2F-1 mRNA相对表达量对患者生存时间的影响进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E2F-1基因在SCLC组织及其癌旁组织中的表达

SCLC组织中E2F-1 mRNA相对表达量为（0.95±0.10），高于癌旁组织中的（0.53±0.08），经t检验，差异有统计学意义（t=40.829，P=0.000）。

2.2 SCLC组织中E2F-1 mRNA与临床病理特征的关系

SCLC组织中E2F-1 mRNA相对表达量与年龄和性别比较，经t检验，差异无统计学意义（P>0.05），而与临床分期和化疗敏感性比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见附表。

2.3 SCLC组织中E2F-1 mRNA对患者预后的影响

以SCLC组织中E2F-1 mRNA相对表达量的P25值为界值，将患者分为低表达组（23例）和高表达（69例），Kaplan-Meier生存分析显示，低表达组患者中位生存时间53.0个月，高表达组患者中位生存时间22.0个月；Log-Rank检验显示，两组患者生存时间比较，差异有统计学意义（χ2=11.517，P= 0.001）。见图1。

附表 临床病理特征与SCLC组织中E2F-1 mRNA的关系

图1 SCLC组织中E2F-1 mRNA对患者生存时间的影响

2.4 E2F-1基因在不同转染组H69和H69AR细胞中的表达

转染培养48 h后，H69细胞中，E2F-1 mRNA相对表达量在E2F-1过表达组、阴性对照组及空白对照组间比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=49.824，P=0.000），E2F-1过表达组高于阴性对照组和空白对照组；H69AR细胞中，E2F-1 mRNA相对表达量在E2F-1干扰组、阴性对照组及空白对照组间比较，差异有统计学意义（F=38.672，P= 0.000），E2F-1干扰组低于阴性对照组和空白对照组。见图2、3。

2.5 上调H69细胞中E2F-1基因表达对化疗药物敏感性的影响

H69细胞对阿霉素IC50值在E2F-1过表达组、阴性对照组及空白对照组间比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=21.964，P=0.000），E2F-1过表达组高于阴性对照组和空白对照组；H69细胞对顺铂的IC50值在E2F-1过表达组、阴性对照组及空白对照组间比较，差异有统计学意义（F=72.752，P=0.000），E2F-1过表达组高于阴性对照组和空白对照组；H69细胞对依托泊苷的IC50值在E2F-1过表达组、阴性对照组及空白对照组间比较，差异有统计学意义（F=35.281，P=0.000），E2F-1过表达组高于阴性对照组和空白对照组。见图4。

2.6 抑制H69AR细胞中E2F-1基因表达对化疗药物敏感性的影响

H69AR细胞对阿霉素IC50值在E2F-1过表达组、阴性对照组及空白对照组间比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=42.753，P=0.000），E2F-1过表达组低于阴性对照组和空白对照组；H69AR细胞对顺铂IC50值在E2F-1过表达组、阴性对照组及空白对照组间比较，差异有统计学意义（F=80.681，P= 0.000），E2F-1过表达组低于阴性对照组和空白对照组；H69AR细胞对依托泊苷IC50值在E2F-1过表达组、阴性对照组及空白对照组间比较，差异有统计学意义（F=64.375，P=0.000），E2F-1过表达组低于阴性对照组和空白对照组。见图5。

图2 E2F-1基因在不同转染组H69细胞中的表达

图3 E2F-1基因在不同转染组H69AR细胞中的表达

图4 上调H69细胞中E2F-1基因表达对化疗药物敏感性的影响

图5 抑制H69AR细胞中E2F-1基因表达对化疗药物敏感性的影响

3 讨论

SCLC作为常见的肺部恶性肿瘤类型，对化疗敏感，初治缓解率较高，但极易出现多药耐药而影响治疗效果[6]，目前，发生化疗耐药的具体机制尚不清楚，积极寻找导致化疗耐药的特异性分子指标，已成为临床研究重点。有研究指出，恶性肿瘤发生多药耐药与细胞周期调控紊乱有关[7]。E2F-1作为重要的转录调控因子，在调控细胞周期及细胞增殖中发挥关键性作用[8]，其异常高表达与食管癌[9]、子宫内膜癌[10]、膀胱癌等[11]多种恶性肿瘤发生、进展及转移过程有关，且影响患者预后。本研究显示，SCLC组织中E2F-1mRNA相对表达量高于癌旁组织，说明E2F-1高表达可能参与SCLC发生过程。与临床病理特征指标相关性分析显示，SCLC组织中E2F-1 mRNA相对表达量与临床分期和化疗敏感性比较，差异有统计学意义（P<0.05），在局限期、化疗敏感的患者组织中呈低表达，提示E2F-1可能参与SCLC病程进展及化疗耐药过程。所有患者接受相同的化疗治疗方案，Kaplan-Meier生存分析显示，低表达组患者中位生存时间53.0个月，高于高表达组患者，说明E2F-1高表达可影响患者预后，提示E2F-1可能通过参与SCLC患者多药耐药而影响患者预后。

为进一步探讨E2F-1对SCLC多药耐药的影响，本研究分别上调人SCLC敏感细胞株H69细胞中E2F-1表达，以及抑制多药耐药细胞株H69AR细胞中E2F-1表达，结果显示，E2F-1过表达组H69细胞对阿霉素、顺铂及依托泊苷的IC50值均高于阴性对照组和空白对照组，说明上调H69细胞中E2F-1表达，可抑制H69细胞对化疗药物的敏感性，而E2F-1干扰组H69AR细胞对阿霉素、顺铂及依托泊苷的IC50值均低于阴性对照组和空白对照组，说明下调H69AR细胞中E2F-1表达，可增强H69AR细胞对化疗药物的敏感性，提示E2F-1与SCLC化疗多药耐药发生密切相关。有研究通过沉默人胃癌耐药裸鼠皮下瘤中E2F-1基因发现，E2F-1可能通过Wnt/β-catenin信号通路而降低肿瘤细胞耐药性，加速细胞凋亡[12]。亦有研究指出，抑制E2F-1可抑制耐吉西他滨人胰腺癌细胞中核糖核苷酸还原酶M2的表达而增强胰腺癌细胞对吉西他滨的敏感性[13]。至于E2F-1调控SCLC多药耐药的具体机制，尚待进一步研究明确。

综上所述，E2F-1在SCLC组织中呈高表达，与患者对化疗敏感性及预后有关，下调E2F-1可增强多药耐药细胞株H69AR对化疗药物的敏感性。

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（童颖丹 编辑）

Correlation of E2F-1 with multidrug resistance and prognosis of small cell lung cancer*

Yuan-wu Jin1,Yuan Zhao1,Xiang-jiao Meng2
(1.Department of Cancer Hematology,Central Hospital of Shandong Zibo Mining Group Co.Ltd,Zibo,Shandong 255120,China;2.Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan,Shandong 250062,China)

ObjectiveTo investigate the effect of E2F-1 on multidrug resistance in small cell lung cancer (SCLC)and its relationship with the prognosis.MethodsThe expression of E2F-1 in the cancerous tissues of 92 patients with SCLC was detected.The effect of the expression ofE2F1mRNA on survival time was analyzed.The human SCLC sensitive cell line H69 and multidrug resistant cell line H69AR were cultured. The cells were divided into E2F-1 overexpression group,negative control group and blank control group, respectively.The drug sensitivity of the cells in different transfected groups were detected.ResultsThe relative expression level ofE2F1mRNA in the SCLC tissues was higher than that in the adjacent tissues (P< 0.05).The median survival time in the low-expression group was longer than that in the high-expression group (P<0.05).The IC50 values of Doxorubicin,Cisplatin and Etoposide for H69 cells in the E2F-1 overexpression group were higher than those in the negative control group and the blank control group (P< 0.05).The IC50 values of Doxorubicin,Cisplatin and Etoposide for H69AR cells in the E2F-1 interference group were lower than those in the negative control group and the blank controlgroup (P<0.05).ConclusionsE2F-1 is highly expressed in SCLC tissues.Reduced expression of E2F-1 could enhance the sensitivity of multidrug resistant cell line H69AR to chemotherapy.

small cell lung cancer;E2F-1;RNA interference;multidrug resistance

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.09.011

1005-8982（2017）09-0054-05

2016-09-14

国家自然科学基金（No：81301868）