CTLA-4(AT)n多态性与过敏性紫癜的相关性研究

侯红红，贺改涛，刘 丽，黄燕萍

(1.西安市中心医院，陕西 西安 710003；2.西安交通大学第一附属医院，陕西 西安 710061)

CTLA-4(AT)n多态性与过敏性紫癜的相关性研究

侯红红1，贺改涛2，刘 丽2，黄燕萍2

(1.西安市中心医院，陕西 西安 710003；2.西安交通大学第一附属医院，陕西 西安 710061)

目的 探讨细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)(AT)n多态性与儿童过敏性紫癜的相关性。方法 选取2014年1月至2015年12月在西安交通大学第一附属医院住院诊断为过敏性紫癜的患儿60例为病例组，另选取健康普查的30例健康儿童作为对照组。采用ABI3130xl测序仪进行毛细管电泳对第4外显子3′端的AT重复序列进行基因分型。分析微卫星的等位基因频率在各组间的分布。结果 ①微卫星(AT)n在病例组和对照组共检出等位基因19种，AT重复次数5～34不等，当AT重复次数为16时，等位基因频率在病例组与对照组间差异有统计学意义(P=0.034，OR=2.115，95%CI：1.049～4.267)；②微卫星(AT)n按有无肾脏损害分层：各等位基因频率在有肾脏损害的过敏性紫癜(HSPN)组与无肾脏损害的过敏性紫癜(NHSPN)组差异均无统计学意义(均P>0.05)；③微卫星(AT)n按性别分层：当AT重复次数为15时，等位基因频率在男女两组间差异有统计学意义(P=0.014，OR=0.210，95%CI：0.055～0.805)。结论 CTLA-4(AT)n基因多态性与过敏性紫癜(HSP)发病相关，AT基因重复次数为16时可能为HSP发病的易感基因，重复次数为15时可能为女性HSP患儿发病的易感基因。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4；基因多态性；过敏性紫癜；儿童

过敏性紫癜又称亨-舒综合征(Henoch-Schonlein Purpura，HSP)，是儿童时期常见的系统性血管炎性疾病，其基本病变为广泛性无菌性小血管炎，以毛细血管壁炎性反应为主，毛细血管脆性和通透性增加，血浆及血细胞渗出，引起皮肤、黏膜以及内脏器官等多部位水肿、出血。该病病理改变为血管壁肿胀和坏死，血小板血栓形成，较重者可见坏死性小动脉炎。HSP的临床特征为皮肤紫癜、消化道症状、关节炎及肾脏损害，少数可累及到神经系统和肺部，累及肾脏而出现蛋白尿和(或)血尿，称为紫癜性肾炎(henoch-schonlein purpura nephritis，HSPN)。该病好发于学龄期儿童，常见发病年龄为3～10岁，一年四季均有发病，冬春季节发病较多，夏季较少。

自HSP被描述以来已有两个世纪之久，学者们对其发病机制进行了不断探索，但目前仍未完全清楚，普遍认为免疫紊乱是其发病的关键，包括体液免疫、细胞免疫及免疫分子的参与。患者体内CD4+/CD8+及Th1/Th2比值发生异常，导致T细胞功能紊乱，多种免疫分子分泌异常，B细胞多克隆活化，促使免疫球蛋白分泌增多，尤其是IgA，IgA免疫复合物沉积于皮肤、内脏血管内皮及肾脏组织，引起血管损伤出血及肾脏损害，出现相应临床症状[1]。流行病学研究提示，HSP具有遗传易感性，该病发病具有有一定家族聚集性，家族中常见聚集倾向，同胞中可见先后发病者[2]。随着基因水平研究技术的提高和深入，学者们对于HSP与基因的研究也越来越多。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte associated ant igen-4，CTLA-4)又名CD152，是免疫球蛋白超家族成员，在激活的T淋巴细胞表面表达，其不仅对T细胞活化起负向调节作用，还可调节T细胞分化[3]，维持机体T细胞相关的免疫平衡，故可推测CTLA-4功能异常会导致自身免疫性疾病的发生，包括HSP。

人类CTLA-4基因位于2q33，包含4个外显子和3个内含子，紧接外显子4的是一段UTR，其中包括一段(AT)n重复序列，AT重复次数较多者，其个体T细胞反应性会随之增强，mRNA的稳定性降低，降解速度增快，CTLA-4蛋白表达水平下降，导致这些个体发生自身免疫性疾病的易感性增加；相反，AT重复次数较少者，其个体可以表达高水平CTLA-4，保护机体免于发生自身免疫性系病,由此可见，CTLA-4基因多态性可决定CTLA-4的表达水平和调节功能。本研究将对(AT)n多态性与HSP的相关性进行探讨。

1材料与方法

1.1研究对象

选取2014年1月至2015年12月在西安交通大学第一附属医院住院的HSP患儿60例为病例组，HSP的诊断符合诸福棠《实用儿科学》[4]中的标准，均为陕西省汉族儿童，均为初发病例，入院前1个月未接受过糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗，排除了其他疾病如血液系统疾病、结缔组织病、原发肾病、乙肝病毒相关性肾炎及狼疮性肾炎等继发性肾脏损害，监护人知情同意。病例组中男性33例，女性27例，平均年龄7.57±2.73岁。按有无肾脏损害分为有肾脏损害的过敏性紫癜(HSPN组)和无肾脏损害的过敏性紫癜(NHSPN组)；HSPN组30例，平均年龄7.77±2.36岁，NHSPN组30例，平均年龄7.37±3.08岁。

对照组来源于西安交通大学第一附属医院门诊健康普查的陕西省汉族儿童，病史询问排除既往过敏性紫癜、系统性红斑狼疮等疾病，4周内无感染及过敏史，经体格检查、肝肾功、尿常规等实验室检查后确定为健康儿童，共30例，其中男性18例，女性12例，平均年龄7.57±2.54岁。

1.2研究方法

1.2.1血标本的采集及DNA的提取

研究对象暂禁食12小时，次日清晨抽取空腹静脉血2mL，置于含有EDTA抗凝液的试管中，于-80℃冰箱低温保存。由北京天根生物公司合成的人类基因组全血DNA提取试剂盒提取DNA。

1.2.2(AT)n基因多态性分析

①取1μL(AT)n PCR产物，加入24μL灭菌超纯水振荡混匀，将PCR产物稀释25倍；②将9μL LIZ500稀释液(0.2μL LIZ500+8.8μL Hi-Di)分装到PCR孔板，然后加入1μL上述25倍稀释的PCR产物，振荡混匀后95°C变性5分钟；③采用ABI3130xl测序仪进行毛细管电泳，所产生的数据文件用Gene Mapper 4.0分析以判断基因型。

1.3统计学方法

统计出CTLA-4基因(AT)n等位基因频率，采用SPSS 18.0统计软件，应用卡方检验比较以上等位基因频率在各组间分布是否存在差异，以此判断某等位基因与疾病的相关性，P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1基因分型胶电泳图

将(AT)n PCR产物适当处理后，采用ABI3130xl测序仪进行毛细管电泳，得到每个样本的分型胶电泳图，单峰的为纯合子，双峰的为杂合子，见图1、图2。

图1 纯合子分型胶电泳图

Fig.1 Homozygous type gel electropherogram

图2 杂合子分型胶电泳图

Fig.2 Heterozygous type gel electropherogram

2.2研究对象的遗传吻合度检验

因微卫星变异较大，本研究纳入病例组60例，对照组30例，所测出的基因型在病例组为30种，在对照组为17种，分别求得病例组与对照组各基因型的实际频数与期望频数后，经比较人群(AT)n位点基因型实际频数与期望频数之间差异均无统计学意义(均P>0.05)，样本具有群体代表性，可用于群体遗传学研究，见表1。

表1 遗传平衡吻合度检验

Table 1 Inspection of genetic equilibrium alignment

STR 病例组 对照组 χ2Pχ2P(AT)n8．5801．0005．7230．991

2.3基因多态性分布情况

本研究CTLA-4(AT)n重复序列依AT重复次数不同可观察到19种等位基因，AT重复次数从5次到34次不等。

2.3.1病例组与对照组各等位基因频率的比较

当AT重复次数为16时，等位基因频率在病例组与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)，此等位基因为HSP发病的危险因素，见表2。

表2 (AT)n等位基因频率在病例组与对照组间的比较结果[n(%)]

注：a表示采用Fisher确切概率检验。

2.3.2病例组中有无肾脏损害分层多态性分析

各等位基因频率在HSPN组与NHSPN组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表3。

表3 (AT)n等位基因频率在HSPN组和NHSPN组的比较结果[n(%)]

注：a表示采用Fisher确切概率检验。

2.3.3病例组中性别分层多态性分析

当AT重复次数为15时，等位基因频率在男女组间比较差异有统计学意义(P<0.05)，此等位基因为女性HSP发病的危险因素，见表4。

表4 (AT)n等位基因频率在男女两组的比较结果[n(%)]

注：a表示采用Fisher确切概率检验。

3讨论

CTLA-4(AT)n序列是位于外显子4末尾3′端的一串AT重复序列，属于STRs，若AT在HSP中以异常高的频率出现，则表明它与HSP发病具有相关性。(AT)n与重症肌无力[5-6]、溃疡性结肠炎及克罗恩病[7-8]的研究均提示它与这些自身免疫性疾病存在相关性，某些异常增高的AT重复次数为这些疾病发病的危险因素。对于此微卫星位点与HSP的相关性，国内外未见报道，本研究为首次对二者进行相关性分析。

3.1(AT)n等位基因频率在病例组和对照组的差异分析

本研究检测到AT重复次数从5次到34次不等，每一个重复次数便代表一种等位基因，共检出19种。通过比较发现，当AT重复次数为16时，等位基因频率在病例组与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)，此等位基因为HSP发病的危险因素；可能系此重复序列影响CTLA-4的分子表达，使其对T细胞的抑制作用减弱，T细胞大量增殖活化，导致免疫分子分泌异常，增加了疾病的发病风险。

3.2(AT)n等位基因频率在有无肾脏损害的差异分析

将HSP组按照有无肾脏损害分层后比较，发现各等位基因频率在HSPN组与NHSPN组间差异均无统计学意义(均P>0.05)，证明各等位基因不能增加HSP患儿发生肾脏损害的风险。

3.3(AT)n等位基因频率在男女间的差异分析

将HSP按性别分层后分析发现，当AT重复次数为15时，等位基因频率在男女两组间差异有统计学意义(P<0.05)，女性组等位基因频率高于男性，说明此等位基因频率可能是女性HSP患儿发病的危险因素；分析原因，可能系存在这些易感基因的患儿体内CTLA-4表达水平下降，T细胞增殖及分化异常，造成免疫紊乱，增加了疾病的发生几率。

综上所述，CTLA-4作为维持机体免疫稳态的一个重要分子，其基因多态性与HSP有着密切的联系，虽然其具体机制尚不能明确，但CTLA-4基因多态性对HSP的易感性、预后判断和治疗有着重要的意义。本次研究的样本量较少，故还需加大样本量去进一步研究证实；也可以进一步研究CTLA-4其他位点基因多态性与HSP的相关性，从基因水平对其发病机制进行探讨。

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[专业责任编辑：吴红艳]

Association between CTLA-4 (AT)n gene polymorphism and Henoch-schonlein purpura

HOU Hong-hong1, HE Gai-tao2, LIU Li2, HUANG Yan-ping2

(1.Xi’anCentralHospital,ShaanxiXi’an710003,China;2.FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To investigate the association between cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4 (CTLA-4) (AT)n gene polymorphism and Henoch-schonlein purpura (HSP) in children. Methods Sixty children diagnosed as HSP in the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University from January 2014 to October 2015 were enrolled in case group. Thirty healthy children receiving health examination were enrolled in control group. Genotyping of 3’untranslated region of exon 4 was performed using capillary electrophoresis with ABI3130xl. Distribution of allele frequencies of microsatellite in different groups was analyzed. Results Totally 19 allele of microsatellite (AT)n were detected in both groups, among which AT repeated from 5 to 34 times. Significant difference was indicated in the comparison of allele frequencies between two groups when the repetition of AT was 16 (P=0.034,OR=2.115, 95%CI: 1.049-4.267). Microsatellite (AT)n was delaminated according to whether there was kidney damage, and there was no statistical significance in allele frequency between HSPN and NHSPN (P>0.05). Microsatellite (AT)n was delaminated according to gender, and there was statistical significance in allele frequency between male and female when AT repeated for 15 times (P=0.014,OR=0.210, 95%CI:0.055-0.805). Conclusion CTLA-4 (AT)n is associated with the susceptibility of HSP. Allele in which AT repeats 16 times may be the susceptible factor of HSP; and allele in which AT repeats 15 times may be the susceptible factor of HSP for female patients.

cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4 (CTLA-4); polymorphism; Henoch-schonlein purpura (HSP); children.

2016-10-19

侯红红(1989-)，女，住院医师，硕士，主要从事儿童肾病的研究。

黄燕萍，主任医师/教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.04.008

R725

A

1673-5293(2017)04-0385-04