基托树脂表面浮游态白色念珠菌的灭活研究*

乔春元 张怀勤

基托树脂表面浮游态白色念珠菌的灭活研究*

乔春元 张怀勤

目的：比较氩气、30% H2O2和50% H2O2等离子体对树脂表面浮游白色念珠菌的杀灭效果。方法：将甲基丙烯酸甲酯制作成9mm×9mm×2mm的试件56块，在浓度为1．0×108CFU/m l白色念珠菌菌悬液中培养2h后取出，PBS轻漂两次，分为14组(n=4)。对照组不做处理，氩气等离子体分别处理20s、40s、60s、80s、100s，30% H2O2和50% H2O2等离子体分别处理5s、10s、15s、20s。处理后洗脱、系列稀释、涂板。48h后计数菌落形成单位，计算杀灭对数值。参考欧洲标准EN 1275-2005，处理后真菌减少＞4 log10CFU视为有效。结果：氩气等离子体处理100s、30% H2O2和50% H2O2等离子体处理15s后，白色念珠菌数量降低均＞4 log10CFU，均能达到有效杀灭。结论：氩气、30% H2O2和50% H2O2等离子体均能有效杀灭树脂表面浮游白色念珠菌。30% H2O2和50% H2O2等离子体杀菌效能优于氩气等离子体。

等离子体；丙烯酸树脂；白色念珠菌；消毒

口腔是一个复杂的生态系，口腔正常微生物群包含细菌、真菌和病毒。目前可摘义齿仍然是牙缺失的修复方法之一,可摘义齿戴入口腔后，暴露于口腔微生物，会被细菌、病毒和真菌污染。在调改、修理和重衬过程中口腔医生和技师会频繁接触义齿，在此之前应对义齿进行消毒，避免意外感染[1]。常用的义齿清洁剂和化学消毒剂可造成表面颜色和粗糙度变化，甚至形成微孔[2]。低温等离子体技术作为消毒医学领域的一项新兴技术，其良好的杀菌性能已得到诸多学者的肯定。低温等离子体消毒技术具有快速，高效，无有害物质残留，且对材料本体性能无影响等优点。前期研究采用等离子体对印模表面乙肝病毒、石膏模型表面金黄色葡萄球菌进行处理，均已取得良好的杀灭效果。本研究采用氩气、30%H2O2和50%H2O2等离子体，对树脂表面浮游态白色念珠菌分别处理不同时间，评估三种等离子体杀菌效果。

1．材料与方法

1．1 材料与设备聚甲基丙烯酸甲酯基托材料(日进中国昆山合资公司)；国际标准菌株白色念珠菌(ATCC90028, 南京便诊生物科技有限公司)；50%过氧化氢(南京康克化工有限公司)；30%过氧化氢(沪试，国药集团化学试剂有限公司)；隔水式恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)；离心机( Thermo，Electron Corporation，德国)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；恒温振荡器(上海易亮医疗器械有限公司)；细菌比浊仪(上海昕瑞仪器仪表有限公司)；HPD-2400次大气压辉光放电低温等离子体表面处理机(南京苏曼电子有限公司)；全自动菌落分析仪(Scan1200, Interscience,法国)。

1．2 基托试件制作将聚甲基丙烯酸甲酯基托材料制成9mm×9mm×2mm的试件56块，表面用600目、800目、1000目砂纸沿同一方向打磨，实验前所有试件先蒸馏水清洗，后超声振荡清洗20m in，并在紫外光下正反面分别照射20m in 灭菌备用。

1．3 试件染菌将复苏的白色念珠菌(ATCC 90028) 种于沙堡培养基，于37℃恒温培养箱中培养。连续传5-7代后，取其培养物，于液态培养基中增菌，37 ℃恒温振荡器(180r/m in)摇床培养18h。取增菌产物，离心机离心(5000r/m in，4℃，6m in) 和磷酸盐缓冲液(phosphate bufffered saline，PBS)清洗2 次后，制备PBS菌悬液，通过细菌比浊仪测定其MCF(麦氏浊度单位)值为0．333，即浓度为1．0×108CFU/m l。试件在灭菌PBS液中浸泡2h后放入24孔板内，每孔加入1m lPBS菌悬液，在30℃隔水式恒温培养箱内放置2h。

1．4 等离子体处理从PBS菌悬液取出试件并用PBS轻漂两次。分为对照组和13个处理组，n=4。对照组不做等离子体处理，氩气等离子体分别处理20s、40s、60s、80s、100s，30%H2O2和50%H2O2等离子体分别处理5s、10s、15s、20s。辉光放电时电压220V，电极距离55mm，电流1．5-1．8A。进行氩气等离子体处理时，标本放于处理基台上，用真空泵将气压降至1800-2000Pa后通入氩气(气体流量约500m l/m in)，当气压升至大气压，用真空泵再次调压至1800-2000Pa，辉光放电。采用30%H2O2和50%H2O2等离子体处理时，将标本和1m l 30%H2O2(或50%H2O2)溶液放于处理基台上，真空泵调压至1800-2000Pa，辉光放电。

1．5 洗脱计数将处理后的试件于2m l PBS液中浸泡2h，超声震荡5m in，取200μl菌液系列稀释、涂板，37℃培养48h，用全自动菌落分析仪计数菌落形成单位，取每组洗脱菌量均值对数值，计数杀灭对数值，评估三种等离子体对试件表面浮游态白色念珠菌的杀菌效果。杀灭对数值为对照组和处理组洗脱菌量对数值之差。参考欧洲标准EN 1275-2005，处理后真菌减少＞4 log10CFU视为有效。

2. 结果

2．1 氩气等离子体杀菌效果(表1) 氩气等离子体处理20s后，树脂试件表面的白色念珠菌数量从5．317 log10CFU下降至4．458 log10CFU，即杀灭对数值为0．859 log10CFU；处理时间延长至100s后，洗脱的真菌数量仅为1．301 log10CFU，杀灭对数值达4．016 log10CFU，能达到有效消毒的要求。

2．2 30%H2O2等离子体杀菌效果(表2) 30% H2O2等离子体处理5s，白色念珠菌菌量降低至2．928 log10CFU，杀灭对数值为2．389 log10CFU；延长处理时间至15s后，存活数量为1．097 log10CFU，杀灭对数值达4．220 log10CFU，达到消毒要求；继续延长处理时间至20s，白色念珠菌仅剩0．875 log10CFU，杀灭对数值为4．442 log10CFU。

表1 氩气等离子体对白色念珠菌的杀菌效果(n=4)

表2 30%H2O2等离子体对白色念珠菌的杀菌效果(n=4)

2．3 50%H2O2等离子体杀菌效果(表3) 50% H2O2等离子体处理试件5s后，真菌数量为2．562 log10CFU，杀灭对数值为2．755 log10CFU ；延长处理时间至15s，树脂表面菌量为1．011 log10CFU，杀灭对数值为4．306 log10CFU，达到消毒要求；50% H2O2等离子体处理20s，仅有0．699 log10CFU真菌存活，杀灭对数值为4．618 log10CFU。

表3 50%H2O2等离子体对白色念珠菌的杀菌效果(n=4)

3．讨论

有研究发现牙科诊室和技工室之间微生物传播，可导致口腔医护人员和技师罹患感染[2]。美国牙科协会规定印模及使用过的修复体在送往技工室之前应该进行清洗并消毒。白色念珠菌致病性强，是口腔中最常见的真菌病原体。戴用义齿后，75%患者口腔内会定植白色念珠菌，通常来源于义齿的组织面，而不是黏膜[3]，因此白色念珠菌是义齿性口炎的主要病原体。义齿性口炎患者常有烧灼感、味觉减退、不适等主诉[4]，且治疗后常有复发，影响患者的生活质量。伴有白色念珠菌感染的口腔黏膜白斑，发生上皮异常增生和癌变的可能性增加[5]。义齿基托在制作、复诊过程中所采用的消毒方法可分为化学消毒法、微波辐射法和机械法。单独使用机械法往往达不到消毒要求，化学消毒法和微波消毒法可对基托的强度、色泽稳定性、表面粗糙度等造成不良影响[6]。医疗物品一旦被念珠菌污染即可形成念珠菌生物膜，念珠菌生物膜对抗真菌药物的耐受较浮游菌更强[7]。因此，应及时清除物体表面的浮游菌，以免形成生物膜，增加消毒难度。

白色念珠菌细胞壁是由甲壳素和β-D-葡聚糖组成的多糖网，支持其机械强度，为糖蛋白提供共价结合的支架[8]。K lampfl等[9]比较了低温大气压空气等离子体对4种革兰阴性菌、11种革兰阳性菌和白色念珠菌的杀灭效果，发现白色念珠菌最难杀灭。故本研究采用氩气、30%H2O2和50% H2O2作为放电介质，评估三种等离子体对白色念珠菌的杀菌效果。由本研究结果可知氩气等离子体处理时间延长至100s，对白色念珠菌的杀灭对数值升高至4．016 log10CFU；而30%H2O2和50%H2O2等离子体处理15s，白色念珠菌的杀灭对数值均＞4 log10CFU，随着处理时间的延长，两种过氧化氢等离子体对白色念珠菌的杀灭效果进一步增强。为了达到EN 1040-2005消毒标准的要求，氩气等离子体所需时间较长(100s)，30%H2O2和50%H2O2等离子体处理15s即可达到有效消毒。等离子体能产生影响杀菌效果的活性物质，包括正负离子和电子、自由基(电离激发的分子产物)、稳态的反应性原子和分子(如臭氧和氢气)、过氧化物、亚稳态的原子和分子、高能光子(如紫外线)等[10]。等离子体的杀菌作用大多归因于其产生的活性氧成分，如O2、O、OH、NO、H2O2等，可诱发氧化应激反应，导致脂质过氧化、铁硫依赖性脱氢酶和单核铁蛋白的失活、DNA损伤，最终对细胞造成氧化损伤[11]，其它成分仅起微弱协同作用。有研究[12]提出等离子体中的活性氧成分通过以下机制杀菌：(i)对细胞膜或细胞壁的直接穿通，导致核酸和蛋白质等胞内物质渗漏；(ii)氧化物或氮化物导致细胞内蛋白的致命损伤；(iii)DNA的直接化学损伤。随着等离子体处理时间的增加，对白色念珠菌的损伤持续进行，最终造成细胞死亡。氩气等离子体和过氧化氢等离子体对浮游态白色念珠菌杀菌效果的差异主要由于它们中的活性氧成分含量不同。氩气等离子体主要放电介质为氩气，30%H2O2和50% H2O2等离子体的放电介质中含有过氧化氢，故辉光放电后过氧化氢等离子体中活性氧成分含量高，能快速、高效杀灭基托树脂表面的浮游态白色念珠菌。

本实验为系列研究的一部分，前期已采用等离子体技术对印模表面乙肝病毒、石膏模型表面金黄色葡萄球菌进行杀灭研究，均取得良好的效果。本研究结果显示氩气、30%H2O2和50%H2O2等离子体均能有效杀灭白色念珠菌，30%H2O2和50% H2O2等离子体的杀真菌效能较氩气等离子体更强，可见等离子体是一项有应用前景的消毒技术。

[1] Nagam atsu Y, Tajim a K, Kak igaw a H, et al． App lication of Electrolyzed Acid W ater to Sterilization of Denture Base Part 1． Exam ination of Sterilization Effects on Resin Plate[J]． Dent Mater J, 2001，20(2)：148-155

[2] Jnanadev KR, Satish Babu CL, Sh ilpa Shetty S, et al． Disinfecting the acry lic resin plate using electrolyzed acid w ater and 2% glutaraldehyde：a com parative m icrobiolog ical study [J]． J Indian Prosthodont Soc, 2011，11(1)：36-44

[3] M atthes R, Jablonow sk i L, Koban I, et al． In vitro treatment of Candida albicans biofilm s on denture base material w ith volume dielectric barrier discharge plasma (VDBD) com pared w ith comm on chem ical antiseptics[J]． C lin Oral Investig, 2015, 19(9)：2319-2326

[4] Pereira CA, Toledo BC, Santos CT, et al． Oppor tunistic m icroorganism s in individuals w ith lesions of denture stomatitis [J]． Diagnostic M icrobiology and Infectious Disease, 2013, 76 (4)：419-424

[5] 钱雅洁, 蒋文晖, 王翔,等． 白色念珠菌白斑中核苷酸结合寡聚化结构域1、核因子κB及人β-防御素的表达[J]． 中华口腔医学杂志, 2014，49(8)：464-469

[6] 李金华, 马长柏, 张雄． 聚甲基丙烯酸树脂义齿基托消毒的研究进展[J]． 口腔医学, 2013, 33(8)：558-560

[7] Maisch T, Sh im izu T, Isbary G, et al． Contact-free inactivation of Cand ida alb icans biofilm s by cold atm ospheric air plasma[J]． Appl Environ M icrobiol, 2012，78(12)：4242-4247

[8] W iegand C, Beier O, Horn K, et al． Antim icrobial im pact of cold atm ospheric pressure p lasm a on med ical critical yeasts and bacteria cu ltu res[J]． Skin Pharm acol Physiol, 2014，27 (1)：25-35

[9] K lampfl TG, Isbary G, Shim izu T, et al． Cold A tmospheric Air Plasma Sterilization against Spores and Other M icroorgan isms of C lin ical Interest[J]． App lied and Environmen tal M icrobiology, 2012，78(15)：5077-5082

[10] O'Connor N, Cah ill O, Dan iels S, et al． Cold atmospheric pressure p lasma and decontam ination． Can it contribute to preven ting hospital-acquired infections[J]． J H osp Infect, 2014，88(2)：59-65

[11] M ai-Prochnow A, M urphy AB, M cLean KM, et al． A tm ospheric pressure plasmas：in fection control and bacterial responses[J]． Int J An tim icrob Agents, 2014． 43(6)：508-517

[12] Vatansever F, de Melo WC, Avci P, et al． Antimicrobial strategies centered around reactive oxygen species-bactericidal antibiotics, photodynam ic therapy, and beyond[J]．FEMS M icrob iol Rev, 2013，37(6)：955-89

Study on inactivation of planktonic Candida albicanson the surfaceofdenturebase resin

QIAO Chun-yuan,ZHANG Huai-qin(Jiangsu Key Laboratory of Oral Diseases,Nanjing Medical University; Departmentof Prosthodontics,Affiliated Hospitalof Stomatology,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective:To investigate the fungicidal effects of different plasma (argon, 30%H2O2and 50%H2O2plasma) on planktonic Candida albicans on the surface of acrylic resin. Methods:Candida albicans were inoculated on polymethyl methacrylate specimens with the size of 9mm×9mm×2mm. Fifty-six resin specimens were random ly divided into fourteen groups (n=4). The specimens in control group did not receive any treatment and the other groups were exposed to argon, 30%H2O2and 50%H2O2plasma for different time durations. Each specimen was immersed into phosphate bufffered saline (PBS) for 2h and sonicated for 5 m in in an ultrasonic bath sonicater. PBS cell suspensions of corresponding specimens were serially diluted. Then aliquots of appropriate dilutions (200μl) were inoculated on Sabouraud dextrose agar and incubated at 37℃for 48h before the colonies were counted. The anticandidal efficacy of plasma was evaluated by the reduction of colony forming units(CFU) in log10. Reduction of 4 log10CFU was regarded as the threshold of clinical relevance in accordance with EN 1275-2005. Resu lts:The reduction of viable Candida albicans on the resin was 4.016 log10CFU with 100s of argon plasma treatment. The inactivation efficacy of 4.220 log10CFU was observed after 15s for 30%H2O2plasma treatment time. The reduction of viable fungi was 4.442 log10CFU w ith the prolonged exposure time of 20s. The anticandidal efficacy of 4.306 log10CFU w as achieved after 15s 50%H2O2plasma treatment. The reduction of Candida albicans cells was increased further up to 4.618 log10CFU when 50%H2O2plasma treatment time extended to 20s. Conclusions:Argon, 30%H2O2and 50%H2O2plasma are effective in inactivation of planktonic Candida albicans on the resin. The anticandidal effects of 30%H2O2and 50%H2O2plasma are superior to that of argon plasma.

Plasma; acrylic resins; Candida albicans; disinfection

R783．6

A

1672-2973(2017)02-0103-04

2016-10-28)

乔春元 南京医科大学口腔疾病研究江苏省重点实验室，南京医科大学附属口腔医院修复科硕士生江苏210029

张怀勤 通讯作者南京医科大学口腔疾病研究江苏省重点实验室，南京医科大学附属口腔医院修复科主任医师副教授江苏210029