座滴法制备鸡蛋白溶菌酶晶体与生长因素探究

张晓婷，唐建国*，张 羽，王 瑶，黄林军，刘继宪，王彦欣，张晓琳，李 潇，Matt J. Kipper, Christopher D. Snow*

（1. 国家杂化材料技术国际联合研究中心，国家高分子杂化材料国际合作基地，青岛大学杂化材料研究院，青岛大学材料科学与工程学院，山东 青岛266071; 2. 科罗拉多州立大学化学与生物工程学院，科罗拉多 柯林斯堡80523，美国）

科研与开发

座滴法制备鸡蛋白溶菌酶晶体与生长因素探究

张晓婷1，唐建国1*，张 羽1，王 瑶1，黄林军1，刘继宪1，王彦欣1，张晓琳1，李 潇1，Matt J. Kipper2, Christopher D. Snow2*

（1. 国家杂化材料技术国际联合研究中心，国家高分子杂化材料国际合作基地，青岛大学杂化材料研究院，青岛大学材料科学与工程学院，山东 青岛266071; 2. 科罗拉多州立大学化学与生物工程学院，科罗拉多 柯林斯堡80523，美国）

蛋白质晶体学的不断发展，使得蛋白质晶体的结晶方法也日趋增多。首次采用了座滴法结晶法，探究不同浓度鸡蛋白溶菌酶溶液，不同温度、NaCl浓度，是否添加mPEG对晶体形貌尺寸的影响。通过显微镜以及扫描电镜观察蛋白质晶体形貌特征，不同条件下的晶体形貌变化，最终获得晶体生长的最适温度以及浓度条件。

鸡蛋白溶菌酶（HEWL）晶体；座滴法结晶；温度；沉淀剂浓度；mPEG

寻找蛋白质结晶的最适生长条件和晶体生长方法，一直以来是晶体培养领域的目标。在某种程度上来说，晶体的生长是科学理论与长久的经验积累得出的[1]。结晶方法的不同也会产生不同的蛋白质晶体。大多数的蛋白质晶体培养多采用以下几种方法结晶。

气相扩散法，主要有悬滴法（The Hanging Drop Method）和座滴法（The sitting-drop method）两种[2-4]。相对于分批法，蛋白质溶液缓慢地形成过饱和溶液，晶体生长的速度可控[5]。悬滴法中，蛋白质与沉淀剂液滴置于处理后的盖玻片上，凹槽中放置沉淀剂。盖玻片反置于生长盘的凹槽之上，油酯密封[6]。但在悬滴法中，如果液滴表面张力过小，会在盖玻片表面展开，导致浓度的分布不均，无法获得晶体[7,8]。

本实验采取座滴法，可以直接使用显微镜观察，无需处理盖玻片，蛋白质液滴不会铺展开。减弱了晶体在悬滴法中受到的重力影响[9]。晶体长成后，便于转移与交联。该方法需要的蛋白质较少，这对于探究晶体生长条件十分方便。在蛋白质晶体培养时，溶菌酶是常用的蛋白质，而鸡蛋白溶菌酶(Hen-egg white Lysozyme简称HEWL)，是溶菌酶群中重要的研究对象，而HEWL是第一个三维结构已知的酶[10]。HEWL化学性质稳定，在pH=4～7范围内，100 ℃处理1 min仍保持原酶活性，在碱性环境中该酶对热稳定性较差，但交联后的晶体耐强酸或强碱以及高温等极端化学环境[11]。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

所用化学试剂均为分析纯，离心后去除杂质。醋酸钠，醋酸，氯化钠,戊二醛（≥50%）均购于上海国药集团化学试剂有限公司，聚乙二醇单甲醚5000（mPEG-5000）购于上海阿拉丁试剂有限公司。鸡蛋白溶菌酶（HEWL）、晶体生长液（30%w/v mPEG5000, 1.0 mol/L NaCl, 0.05 mol/L NaAc pH4.6）与 24孔坐滴晶体生长盘以及透明晶体密封胶带均购于Hampton research 公司。

所用到的仪器有德国 Brand 数字可调式单道移液枪（量程范围2～20μL），梅特勒恒温磁力搅拌器，重庆奥特体视连续变倍显微镜，TGL-16M湘仪冷冻离心机，扫描电子显微镜（JSM-7500F日本电子株式会社），雷磁pH计。

1.2 鸡蛋白溶菌酶(HEWL)溶液的配制

在室温下，使用pH配制pH=6.4的0.05 mol/L的醋酸钠-醋酸缓冲液作为溶剂。配制20、30、40、50 g/L的HEWL的醋酸钠溶液。

1.3 晶体生长沉淀剂的制备

本实验使用的晶体沉淀剂分别为购于 Hampton research的晶体生长液，以及不同浓度的NaCl、不同pH的NaAc、聚乙二醇单甲醚（mPEG）混合溶液，配制浓度为4 mol/L的NaCl溶液，0.1 mol/L的pH 4.6 NaAc溶液，母液稀释法配制不同NaCl浓度的沉淀剂。

1.4 座滴法制备鸡蛋白溶菌酶(HEWL)晶体

一定浓度的 HEWL的醋酸钠溶液，吸取大于100μL的沉淀剂于B中，1～10μL 的HEWL蛋白质溶液于A中，并从B中1～10μL沉淀剂于A中，使得A中蛋白质溶液与沉淀剂形成过饱和溶液，胶带密封，恒温静置生长。待晶体生长完成后，加入少量戊-二醛溶液密封交联，长期保存(图1)。

1.5 不同温度下的晶体生长

按照表1制备HEWL的醋酸钠溶液。在15、25、30 ℃下，生长晶体。沉淀剂中还含有30%w/v MPEG、0.05 mol/L NaAc pH=4.6。

图1 座滴法晶体生长装置Fig.1 Sitting-drop method device

表1 不同温度下晶体生长条件Table 1 Crystal growth conditions at different temperatures

1.6 不同NaCl浓度下晶体生长

按照表2配制沉淀液，在25 ℃下，选择40 g/L HEWL溶液，生长晶体。

表2 不同浓度的NaCl溶液Table 2 Different concentrations of NaCl solution

1.7 mPEG-5000对晶体生长的影响

对表2中的NaCl溶液，添加30%w/v 的mPEG。在25 ℃下，40 g/L的HEWL溶液，生长晶体。

2 结果与讨论

2.1 鸡蛋白溶菌酶晶体（HEWL）表征

图2a中，HEWL晶体为六方晶体和四方晶体，无色透明，有明显的边界。选取四方晶体进行洗涤交联后，晶体由无色透明，变为透明浅黄色。戊二醛与蛋白质中氨基结合，发生了分子间交联，蛋白质变性[12,13]，晶体结构稳定性增强，可以承受高能电子束扫描。图2c和图2d为晶体的SEM测试图，在HEWL晶体中，存在大量水通道，在样品制备过程中，真空干燥使HEWL晶体表面发生了失水皱缩，HEWL晶体内部蛋白质浓度升高，可以观察到晶体表面析出新的 HEWL蛋白质，产生新的小尺寸HEWL片晶[14-17]。

图2 a、b为晶体交联前与交联后的显微镜图片; c、d为晶体的扫描电镜图片Fig.2 a b for the crystal before and after crosslinking microscope pictures, c d for the SEM image of the crystal

2.2 温度对HEWL晶体生长的影响

图3可见，低温下，成核迅速，但生长速度低，产生大量的微晶。温度升高，晶体成核慢，生长速度快，产生大尺寸的不规则晶体。在 15 ℃时，发现低浓度的蛋白质溶液会产生小尺寸的晶体，产生了孪晶[18]。

该温度下 HEWL溶液迅速达到饱和或过饱和状态，导致晶核成核快，晶核数目多，晶体尺寸变小。25 ℃，HEWL在浓度20～40 g/L时，晶体的形貌大多为规则的四方晶体，存在极少的孪晶，随着蛋白质浓度增加，晶体尺寸逐渐增大。在 30 ℃，温度过高，形貌发生变化，晶体为尖锐的星型，晶体数量随着浓度的增大而增多。当HEWL溶液浓度达到50 g/L时，均由于浓度过大，导致晶核数目过多，无大尺寸晶体生成[18-20]。

图3 15 ℃时HEWL浓度分别为20 ～ 50 g/L的HEWL晶体（a-d）；25 ℃时HEWL浓度分别为20 ～ 50 g/L HEWL晶体（e-h）；30 ℃时HEWL浓度分别为20 ～50g/L HEWL晶体（标尺均为100 μm）Fig.3 HEWL in 20 g/L to 50 g/L crystals at 15 ℃(a-d); HEWL in 20 g/L to 50 g/L crystals at 25 ℃(e-h); HEWL in 20 g/L to 50 g/L crystal at 30 ℃(scale = 100 μm)

可以得出结论，温度低于25 ℃，晶体生成数目会随蛋白质溶液浓度升高而增多，因低温迅速结晶而产生孪晶。而温度高于25 ℃，晶体生长会发生晶体变形，晶核生长过程因升温而加速，晶核无法良好的生长，形貌发生改变。因此温度过高或过低都无法得到形貌良好的晶体[21]。

2.3 不同NaCl浓度下晶体生长

图4可以看出，NaCl浓度影响晶体的生长，随着NaCl浓度的增加，晶体尺寸由小增大，尺寸分布呈现曲线变化，晶型为棒状晶。在浓度为1.3 mol/L时，棒状晶体的数量减少，长径比增大，晶体尺寸增大。在d图中，NaCl浓度过大，导致晶核增多，晶体无法继续生长，棒状晶体的尺寸减小，易断裂。晶体在浓度为1.3 mol/L时达到最佳，浓度继续增大，则晶体会由于沉淀剂浓度增大，晶核增多，无法形成完美晶型的四方晶体。过饱和的蛋白质溶液可以经过热力学诱导而分离成2个介稳的浓度相差较大的液相，即不稳定区(labile region)和亚稳区(metastable region)。由图4f中蛋白质晶体生长相图来看，晶体生长需要达到高的过饱和度，如果过饱和度太小，成核速率慢，晶体未生成，这个状态为亚稳区。在非稳区或者结晶区的任一点，溶液自发结晶，在温度不变时，溶液浓度会逐渐下降，直至饱和线界限。因此，溶液需要在亚稳区或非稳定区才能结晶。当浓度继续增大，达到沉淀区，会产生无序结构，造成大量晶核生成。因而蛋白质溶液与NaCl溶液的浓度需要在非稳区范围内。

图4 25 ℃下，40 g/L HEWL溶液，HEWL晶体（无mPEG，标尺均为100 μm）Fig.4 25 ℃, 40 g/L HEWL, HEWL crystals (no mPEG, scale are 100 μm)

2.4 mPEG对晶体生长的影响

对比图4，可以发现图5晶体的形状由棒状晶体变为四方晶体，晶体尺寸均一、形状规则。晶体的生长过程中会受到液相流动的影响，导致晶体发生变形以及晶格缺陷增多，也会使得晶体无法生成。图5在晶体生长的沉淀剂中加入mPEG后，溶液粘度增大，降低了体系流动性和晶体生长速度，晶体不易变形。

图5 加入30%w/v mPEG后，不同NaCl浓度生长出的晶体Fig.5 After adding 30%w/v mPEG, HEWL crystallization of different NaCl concentration

3 结 论

座滴法（the sitting-drop method）结晶法，改进了悬滴法中对于玻片的硅化过程，避免了蛋白质溶液液滴表面张力不足而导致的平铺在玻片表面，同时更加方便利用显微摄像技术记录检测蛋白质晶体情况。HEWL蛋白质晶体的生长过程受温度、浓度、以及mPEG的影响,晶体生长存在最佳环境条件，本体系在温度为25 ℃,NaCl浓度处于1.1～1.5 mol/L之间，且加入mPEG的条件下，可以获得形状尺寸良好的HEWL四方晶体。

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科思创一季度净利润4.68亿欧元 聚氨酯业务表现强势

科思创于4月25日公布了其第一季度财报。数据显示，公司第一季度净利润由去年同期的1.82亿欧元飙升至4.68亿欧元。其中，聚氨酯业务呈现出的三倍增长起到了至关重要的作用。

截至2017年3月，公司第一季度营业额为35.9亿欧元，同比增长24.7%，息税折旧及摊销前利润也强势上行近66.5%，达到了8.46亿欧元。第一季度营业利润为6.88亿欧元，较去年同期的3.4亿欧元上涨一倍有余。

科思创首席执行官Patrick Thomas对此赞誉有加：“公司展现出了强劲的增长势头，其息税折旧及摊销前利润也已连续九个月处于上行轨道之中。”

科思创聚氨酯业务第一季度营业利润从去年同期的1.17亿欧元蹿升至3.96亿欧元，营业额也上涨35%，达18.9亿欧元。其中，聚碳酸酯业务营业利润为 1.84亿欧元，较去年同期涨幅达 44.9%。涂料、胶黏剂以及各类特殊化学品业务利润也小涨3.4%，收于1.23亿欧元。

据科思创宣称，第一季度销售额所显现出的 24.7%的增长是由多项因素共同推动的，比如第一季度总销售量与平均销售价格分别上升了9%与13.4%，以及聚氨酯售价抬升25.8%等。

科思创首席财务官Frank Lutz对此表示：“公司第一季度的活跃表现更坚定了我们对整个2017财年的信心。其原因显而易见——全球建筑业以及北美与亚太地区家具、床垫业的市场需求日益增长，无疑为公司第一季度的迅猛增长提供了动力。”

科思创曾与2015年宣布永久关闭位于西班牙塔拉戈纳的MDI装置，这一计划在公布后随即搁浅。若非科思创维持装置运转至今，也不会有当下的一片欣欣向荣。

同时，科思创早在2016年6月就计划对位于德国北部城市布伦斯比特尔的一处工厂进行改建，力争到2018年实现产能倍增。届时，该厂MDI年产能将达到40万吨每年。

尽管科思创并未在周二的报告中公布具体数字，但有关人士称：第一季度的成功极大提振了公司在实现原定营销目标方面的信心。据预测，与过去三年平均水准相比，公司2017年度净现金流将呈现出较为明显的涨幅。

Study on Growth Factors of Hen-Egg White Lysozyme Crystallization by Sitting-drop Method

ZHANG Xiao-ting1,TANG Jiang-guo1*,ZHANG Yu1,WANG Yao1,HUANG Lin-jun1,LIU Ji-xian1,WANG Yan-xin1,ZHANG Xiao-lin1,LI Xiao1,Matt J. Kipper2,Christopher D. Snow2*

（1. The National Base of International Scientific and Technological Cooperation on Hybrid Materials, The International Cooperation Base of National Polymer Hybrid Materials, Institute of Hybrid Materials of Qingdao University, Department of Material Science and Engineering, Qingdao University, Shandong Qingdao 266071，China；2. Department of Chemical and Biological Engineering, Colorado State University Colorado Fort Collins, CO 80523, USA）

The development of protein crystallography promotes the improvement of crystallization method of protein crystals. In this paper, effect of hen egg white lysozyme concentration, temperature, NaCl concentration and adding mPEG or not on size and pattern of protein crystals was investigated. The crystal morphology of the protein was observed by microscope and Scanning Electron Microscope, and the optimum temperature and concentration conditions were obtained in the end.

Hen-egg white lysozyme crystals; Sitting-drop method; Temperature; Concentration of precipitant；MPEG

O 743

A

1671-0460（2017）04-0573-04

(1)国家自然科学基金(#51273096，#51373081，#51473082);

(2)国家高端外国专家项目(GDW20143500164, GDT20153500059, GDW20143500164)；

(3)国家重点研发计划“政府间国际科技合作”重点专项(2016YFE10800) ;

(4)国家创新引智计划“111计划”。

2017-03-13

张晓婷（1992-），女，山东省潍坊市人，研究生，硕士，2017年毕业于青岛大学材料学，研究方向：蛋白质晶体稀土杂化材料。E-mail：17864215552@163.com。

唐建国（1958-），男，教授，博士，高分子杂化材料研究。E-mail：jianguotangde@hotmail.com。