补阳还五汤抗阿尔茨海默病有效成分的分离与鉴定

董晓红++刘斌++姚壮++刘海洋+++张艳++周忠光

[摘要] 目的 研究补阳还五汤化学成分。方法 利用现代植物化學手段，对补阳还五汤的水提物进行硅胶柱层析，最后通过制备型液相色谱的方法得到纯的化合物单体，并通过现代波谱学的方法对其结构进行鉴定。结果 从中共分离并鉴定了5个化合物，分别为xanthokeisminsA （1）， xanthokeisminsB （2），2'，4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'，5'-dimethylchalcone（3），5，7，3'，4'-tetrahydroxy-2'-（3，3-dimethylallyl） isoflavone （4）和3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1-2）-β-D-glucuronopyranosyl-22-O-β，β-dimethylacryloyl-A1-barrigenol （5）。结论 化合物1～5均为首次从补阳还五汤中分离得到。

[关键词] 补阳还五汤；化学成分；分离；结构鉴定；阿尔茨海默病

[中图分类号] R914 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（b）-0015-03

[Abstract] Objective To investigate the anti-Alzheimer′s disease active ingredients of BuyangHuanwu Decotion. Methods After the decotion was extracted and subjected to silica gel chromatography to obtain subfractions， then the purified compounds were isolated by pre-HPLC method. And their structures were elucidated by comprehensive spectroscopic methods. Results Five compounds were separated and identified as xanthokeismins A （1）， xanthokeismins B （2）， 2'，4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'，5'-dimethylchalcone （3），5，7，3'，4'-tetrahydroxy-2'-（3，3-dimethylallyl） isoflavone （4）， and 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1-2）-β-D-glucuronopyranosyl-22-O-β，β-dimethylacryloyl-A1-barrigenol（5）， respectively. Conclusion Compounds 1-5 were isolated from BuyangHuanwu Decotion for the first time.

[Key words] BuyangHuanwu Decoction； Chemical Constituents； Isolation； Identification ； Alzheimer's Disease

补阳还五汤出自清代王清任的《医林改错》，由黄芪、当归、赤芍、桃仁、川芎、红花、地龙7味中药组成。诸药合用，共奏补气活血、通经活络之功效[1]。现代药理研究表明，补阳还五汤具有改善脑血循环和微循环[2-3]、促进血管新生[4]、抗细胞凋亡[5-6]、对抗兴奋性氨基酸[7]等药理作用。补阳还五汤以往多用于治疗缺血性脑血管疾病[8-10]。本课题组采用大鼠单侧海马区定向注射Aβ1-40 复制阿尔茨海默病（AD）动物模型，从整体、细胞、分子和基因水平，探讨补阳还五汤对AD模型大鼠的作用及相关机制。研究结果表明，补阳还五汤对Aβ1-40所致AD模型大鼠学习记忆障碍具有明显改善作用[11]；可显著地降低AD模型大鼠海马和皮质Aβ沉积，改善Aβ所造成的神经元和微血管损害，减轻脑组织炎性反应；并且可以影响免疫炎性细胞因子及相关基因的表达[12-14]。但相关补阳还五汤的化学成分报道较少，为明确其抗AD的物质基础，本文对补阳还五汤的化学成分进行研究，以阐明该方药效的物质基础。从复方中分离并鉴定了5个化合物，分别为xanthokeisminsA（1）， xanthokeisminsB （2），2'，4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'，5'-dimethylchalcone（3），5，7，3'，4'-tetrahydroxy-2'-（3，3-dimethylallyl） isoflavone （4）和3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1-2）-β-D-glucuronopyranosyl-22-O-β，β-dimethylacryloyl-A1-barrigenol （5）。

1 仪器与材料

Bruker 400 核磁共振仪（德国Bruker公司），硅胶（200～300目）、硅胶板（高效板）（青岛海洋化学有限责任公司），制备型高效液相色谱仪（Agilent 1200），XBridge Prep C18 （10 μm，10 mm×250 mm），高效液相色谱用化学试剂为色谱纯（ThermoFisher公司），Quintix125D-1CN分析天平（德国赛多利斯集团）。复方中药材购自河北安国中药材市场，由黑龙江中医药大学陈效忠副教授分别鉴定为黄芪、归尾、赤芍、地龙、川芎、桃仁和红花。

2 提取分离

将该复方（黄芪1200 g、归尾60 g、赤芍45 g、地龙30 g、川芎30 g、桃仁30 g、红花30 g）经水煮3次，合并滤液，浓缩后经石油醚（体积比1︰1）萃取3次，得余下水提物550 g，选用氯仿-甲醇系统进行硅胶柱层析，根据薄层色谱鉴别的方法合并相同/相似馏分，得10个部分（Fr1～Fr10），其中Fr8（30 g）多次通过石油醚-丙酮，氯仿-丙酮系统，硅胶柱层析的方法，后经制备型HPLC（甲醇-水作为洗脱剂）的方法得到化合物1 （18.0 mg）， 2 （22.5 mg），3 （27.6 mg），4（15.0 mg），5 （10.5 mg）和6 （22.3 mg）。

3 结构鉴定

3.1 化合物1

淡黄色油状，溶于氯仿-甲醇混合溶剂。1HNMR（CDCl3，400 MHz）δ：7.46（1H，d，J=15.4 Hz，H-α），7.84（1H，d，J=8.8 Hz，H-β），7.55（1H，d，J=8.8 Hz，H-2），6.87（1H，d，J=8.8 Hz，H-3），6.88（1H，d，J=8.8 Hz，H-5），7.56（1H，d，J=8.8 Hz，H-6），6.43（1H，d，J=8.8 Hz，H-5'），7.71（1H，d，J=8.8 Hz，H-6'），3.45（2H，d，J=7.0 Hz，H-1''），5.34（1H，m，J=7.0 Hz，H-2''），2.76（2H，d，J=6.6 Hz，H-4''），5.70（1H，m，J=15.8，6.6 Hz，H-5''），5.68（1H，d，J=15.8 Hz，H-6''），1.34（3H，s，H-8''），1.34（3H，s，H-9''），1.83（3H，s，H-10''）；13CNMR（CDCl3，100 MHz）δ：192.2（C=O），117.6（C-α），144.3（C-β），126.9（C-1），130.6（C-2），116.0（C-3），159.6（C-4），116.0（C-5），130.5（C-6），113.7（C-1'），161.9（C-2'），115.3（C-3'），163.8（C-4'），107.3（C-4'），129.1（C-6'），21.9（C-1''），123.1（C-2''），134.6（C-3''），42.7（C-4''），129.5（C-5''），134.9（C-6''），82.1（C-7''），24.5（C-8''），24.4（C-9''），16.4（C-10''）。以上数据与文献[15]基本一致，故鉴定化合物为xanthokeismins A，化学结构式见图1。

3.2 化合物2

淡黄色油状，溶于氯仿-甲醇混合溶剂1HNMR（CDCl3，400 MHz）δ：7.46（1H，d，J=15.2 Hz，H-α），7.85（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），7.58（1H，d，J=8.2 Hz，H-2），6.91（1H，d，J=8.2 Hz，H-3），6.91（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），7.58（1H，d，J=8.2 Hz，H-6），6.49（1H，d，J=8.7 Hz，H-5'），7.95（1H，d，J=8.7 Hz，H-6'），5.64（1H，d，J=3，5 Hz，H-1''），4.52（1H，d，J=3，5 Hz，H-2''），2.38（1H，dd，J=14.0，6.6 Hz，H-4''），2.45（1H，dd，J=14.0，6.6 Hz，H-4''），5.79（1H，m，J=15.9，6.6 Hz，H-5''），5.72（1H，d，J=15.9 Hz，H-6''），1.36（3H，s，H-8''），1.34（3H，s，H-9''），1.19（3H，s，H-10''）；13CNMR（CDCl3，100 MHz）δ：190.8（C=O），115.0（C-α），143.5（C-β），124.9（C-1），129.1（C-2），114.4（C-3）158.5（C-4），114.4（C-5），129.2（C-6），114.6（C-1'），160.8（C-2'），115.4（C-3'），165.6（C-4'），100.8（C-4'），132.2（C-6'），68.4（C-1''），95.5（C-2''），71.1（C-3''），40.3（C-4''），123.4（C-5''），137.2（C-6''），80.1（C-7''），22.9（C-8''），22.6（C-9''），20.2（C-10''）。以上数据与文献[15]基本一致，故鉴定化合物2为xanthokeismins B，化学结构式见图1。

3.3化合物3

橘色粉末，溶于甲醇溶液。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：7.66（1H，d，J=7.2 Hz，H-2），7.44（1H，m，H-3），7.44（1H，m，H-4），7.44（1H，m，H-5），7.67（1H，d，J=7.2 Hz，H-6），8.01（1H，d，J=15.7 Hz，H-α），7.86（1H，d，J=15.7 Hz，H-β），2.16（3H，s，CH3-3'），2.17（3H，s，CH3-5'），3.68（3H，s，OCH3-6'）。以上数据与文献[16]基本一致，故鉴定化合物为2'，4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'，5'-dimethylchalcone，化学结构式见图1。

3.4化合物4

橙色粉末，溶于甲醇溶液。1HNMR（CDCl3，400 MHz）δ：7.89（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），6.29（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），6.43（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），6.76（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），6.56（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），3.30（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），5.08（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），1.43（1H，d，J=15.2 Hz，H-β），1.52（1H，d，J=15.2 Hz，H-β）。以上數据与文献[17]基本一致，故鉴定化合物4为5，7，3'，4'-tetrahydroxy-2'-（3，3-dimethylallyl）isoflavone，化学结构式见图1。

3.5化合物5

白色无定型粉末，溶液甲醇溶液。1HNMR（CDCl3， 400 MHz）δ：0.72（2H，H-1a），1.28（2H，H-1b），1.73（1H，H-2a），2.09（1H，H-2b），3.21（1H，dd，J=10.5，5.5 Hz，H-3），0.71（1H，H-5），1.21（2H，H-6a），1.44（2H，H-6b），1.95（2H，H-7），2.03（2H，H-7），1.61（1H，H-9），1.77（2H，H-11a），1.83（2H，H-11b），5.52（1H，m，t，J=3.0 Hz，H-12），4.21（1H，d，J=3.8 Hz，H-15），4.48（1H，d，J=3.8 Hz，H-16），2.97（1H，dd，J=13.6，3.0 Hz，H-18），1.29（2H，H-19a），2.79（2H，t，J=13.6 Hz，H-19b），1.93（3H，H-21a），2.68（3H，t，J=10.9 Hz，H-21b），6.02（1H，dd，J=10.9，4.0 Hz，H-22），1.14（3H，s，H-23），0.89（3H，s，H-24），0.75（3H，s，H-25），1.01（3H，s，H-26），1.78（3H，s，H-27），3.52（1H，d，J=10.9 Hz，H-28a），3.71（1H，d，J=10.9 Hz，H-28b），0.99（3H，s，H-29），1.21（3H，s，H-30）；GlcA4.78（1H，d，J=7.2 Hz，H-1），4.50（1H，H-2），4.04（1H，t，J=8.0 Hz，H-3），4.12（1H，H-4），4.38（1H，t，J=8.7 Hz，H-5）；Rha5.84（1H，m，H-1），4.87（1H，m，H-2），4.54（1H，H-3），4.18（1H，H-4），4.84（1H，H-5），1.52（1H，d，J=5.8 Hz，H-6）。以上数据与文献[19]基本一致，故鉴定化合物为3-O-α-L-rhamnopyranosyl-（1-2）-β-D-glucuronopyranosyl-22-O-β，β-dimethylacryloyl-A1-barrigenol，化学结构式见图1。

4讨论

AD的治疗一直是医学界的难题，从中药中寻找多成分、多靶点、毒副作用小的AD治疗药物是一种有效途径[15-17]。补阳还五汤具补气活血、通经活络之功效，药理实验表明该复方对AD模型大鼠学习记忆障碍具有明显改善作用，具有抗阿尔茨海默病的作用，为弄清其药效学物质基础，本文开展了相应的化学方面的研究工作[18-20]。从复方中分离并鉴定了5个主要的化合物，这些化合物可能是治疗阿尔茨海默病的效用物质。

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（收稿日期：2017-01-10 本文编辑：王 丽）