兰州熊蜂（Bombus lantschouensis）SMPD基因原核表达诱导条件的优化

韩 蕾董 捷黄家兴和绍禹吴 杰

（1云南农业大学东方蜜蜂研究所，昆明650201；2中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部授粉昆虫生物学重点开放实验室，北京100093）

兰州熊蜂（Bombus lantschouensis）SMPD基因原核表达诱导条件的优化

韩 蕾1,2董 捷2黄家兴2和绍禹1吴 杰2

（1云南农业大学东方蜜蜂研究所，昆明650201；2中国农业科学院蜜蜂研究所，农业部授粉昆虫生物学重点开放实验室，北京100093）

兰州熊蜂(Bombus lantschouensis)是我国优良熊蜂蜂种，已成功实现人工饲养并应用于设施作物授粉。鞘磷脂磷酸二酯酶（SMPD）是一种水解酶，参与鞘磷脂代谢过程并起关键作用。本研究从诱导温度、IPTG浓度及诱导时间三个因素对SMPD基因的原核表达进行优化，以期获得最佳原核表达条件。结果表明：诱导温度与诱导时间是影响SMPD蛋白表达量的主要因素，而诱导剂IPTG浓度影响较小。当温度为10℃，IPTG终浓度为0.1 mM，诱导时间为32 h时，目的蛋白表达量高，特异性好，能够满足该蛋白后续纯化实验要求。本研究结果为进一步开展SMPD蛋白功能研究奠定重要基础。

兰州熊蜂；原核表达；SMPD基因；诱导条件

1 引言

鞘磷脂磷酸二酯酶（sphingomyelin phosphodiesterase,SMPD）是一种水解酶，能水解神经鞘磷脂生成神经酰胺[1]，参与细胞凋亡、生长抑制等生理病理活动。研究发现该基因与哺乳动物的寿命和某些疾病相关，Kenichi Horinouchi等[2]利用基因敲除技术敲除小鼠SMPD基因后，小鼠出现生长缓慢、神经退化及寿命缩短等变化。随后，Schneider等[3]首次在尼曼匹克病（Niemann.Pick Disease，NPD)患者中发现SMPD基因处于缺乏状态。此外，高军等[4]通过RNA干扰技术发现该蛋白能够参与哺乳动物卵巢的保护，研究表明SMPD基因被激活后释放到细胞表面，水解细胞膜上的鞘磷脂酶，导致神经酰胺水平在数秒到数分钟内迅速上升，从而阻断鞘磷脂酶的表达并抑制卵母细胞在抗肿瘤治疗过程的凋亡。

在昆虫中，SMPD基因的研究较少。Kraut等[5]在研究神经鞘脂类对果蝇发育和疾病的作用中发现：果蝇饲喂糖水后，鞘磷脂酶和神经酰胺水平下调，而脂肪酸水平上调，因此推测该脂类可能在抑制脂肪酸合成中发挥作用。2012年，Joshua等[6]发现通过siRNA技术沉默妊娠期雌性舌蝇SMPD基因，导致雌性舌蝇的妊娠期延长，子代数量和羽化能力降低，子代热耐受力受损，共生菌减少以及影响子代繁殖力等一系列问题。因此，昆虫SMPD基因可能参与昆虫的生殖过程。然而，关于SMPD基因在熊蜂上的研究还未见报道，兰州熊蜂（Bombus lantschouensis）是我国良种熊蜂之一，被应用于温室作物授粉[7]。因此，开展熊蜂SMPD基因研究，对该基因在熊蜂中的作用具有重要的指导意义。

前期实验已通过PCR扩增了SMPD基因片段，并成功构建了原核表达载体pCold-II-SMPD；该载体转入大肠杆菌后，经异丙基-β-D巯基半乳糖苷（IPTG）诱导后表明有融合目的蛋白表达。因此，本研究拟对兰州熊蜂SMPD基因原核表达条件进行优化，以期获得高量表达SMPD蛋白，为制备SMPD蛋白的抗血清及进一步功能研究奠定基础。

2 材料与方法

2.1 菌液的活化及其鉴定

pCold-II-SMPD重组质粒的BL21（DE3）重组菌由本研究室保存。按照1∶50将含pCold-II-SMPD重组质粒的重组菌添加到5 ml含氨苄青霉素（AMP）的LB液体培养基中，37℃、200 rpm/min震荡培养过夜；提取pCold-IISMPD重组质粒（中科瑞泰生物科技有限公司，北京）并用EcoRⅠ、SacⅠ限制性内切酶（New England Biolabs，美国）双酶切鉴定。

2.2 重组菌IPTG诱导浓度的优化

取一管活化后的菌液按照1∶50加到5 mL含Amp的LB液体培养基中，37℃、200 rpm/min振荡培养；待菌液OD600达到0.4~0.6时，冰浴10 min，15℃放置30 min，加入诱导剂IPTG，使其终浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mM，放入15℃中诱导24 h，震荡速度为160 rpm/min。

2.3 重组菌IPTG诱导温度的优化

取一管活化后的菌液按照2.2中的方法进行诱导前样品准备，IPTG终浓度分别为0、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mM，分别放入4和10℃中诱导24 h，震荡速度为160 rpm/min。

2.4 重组菌诱导时间的优化

取一管活化后的菌液按照2.2中的方法进行诱导前样品准备，根据确定最适IPTG浓度和最适温度，以160 rpm/min分别诱导8、16、24、32 h。

菌液诱导结束后于4℃、12000 rpm/min离心5 min；弃上清液，向菌体沉淀中加入1.5 ml PBS悬浮沉淀，再进行上述离心，如此重复3次进行菌体漂洗；按照细菌蛋白提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，北京）的方法进行蛋白提取；将提取获得的上清和沉淀分别加入上样缓冲液混匀，100℃煮沸5 min；各取7 μl。通过12%SDS-PAGE电泳检测，考马斯亮蓝R250染色液染色30 min；最后，用脱色液脱色至条带清晰，扫描分析。

3 结果与分析

3.1 重组质粒鉴定

将pCold-II-SMPD重组质粒经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切及电泳后，获得两个大小约为900和4800 bp条带，与SMPD基因片段和pCold-II质粒片段长度一致（图1），酶切鉴定结果表明，所得重组质粒为目的重组质粒，经活化后的菌液可直接用于后续实验。

图1 pCold-II-SMPD重组质粒双酶切鉴定

3.2 不同温度与IPTG浓度对SMPD蛋白表达量的影响

通过对SMPD重组菌进行不同温度与IPTG浓度组合诱导，结果表明：温度对总蛋白的表达量影响较大，随着温度升高，总蛋白表达量呈递增的趋势；当诱导温度相同时，不同IPTG浓度对重组蛋白的表达量影响较小，经比较分析确定该蛋白诱导最优的温度和IPTG浓度组合为10℃和0.1 mM（图2）。

3.3 不同诱导时间对SMPD蛋白表达量的影响

将SMPD蛋白以优化后的最适温度和IPTG浓度进行不同时间诱导表达，结果显示：诱导温度为10℃，诱导剂IPTG浓度为0.1 mM时，诱导时间在8、16、24和32 h时该蛋白均有表达，但在32 h时表达量最高。（图3）。

4 讨论

通过原核表达获得大量目的蛋白是深入开展基因功能研究的前提，而原核表达过程中，蛋白表达量不仅受目的基因序列的影响，同时也与表达菌株、表达系统、诱导剂IPTG浓度、诱导时间和诱导温度等因素相关[8-11]。本研究首次对熊蜂SMPD基因的原核表达的诱导温度、诱导剂浓度及诱导时间进行了优化，发现各优化条件对原核表达的影响程度不同，其中诱导温度及诱导时间影响较大，而IPTG浓度影响较小。

在本研究中，随着IPTG浓度的升高，SMPD蛋白表达量未出现明显变化，此结果与陈雪燕等[12]研究结果一致。由于IPTG作为原核表达的诱导剂，具有不被菌体代谢、诱导效果长久且诱导效率高[13]等优点，但是高浓度的IPTG会对菌株产生一定的毒害作用，因此，在诱导效果没有显著差异的情况下，选择0.1 mM为最适诱导剂浓度。原核表达的诱导温度不仅影响菌体的生长，同时也影响重组质粒的稳定性和融合蛋白的表达水平，本研究在比较4、10和15℃这三个诱导温度时，发现总蛋白表达量随温度升高呈递增趋势。其中，SMPD目的蛋白表达量逐渐增高，但与此同时非目的蛋白的表达量也明显增多，表明温度的增加也促进了细菌内其他蛋白的表达，因此综合目的蛋白表达量和表达特异性，选择10℃作为最适诱导温度。

本次实验中，兰州熊蜂SMPD基因在各种诱导条件下均以包涵体形式存在，在细胞破碎后的上清中几乎未找到目的重组蛋白，而原核表达过程中，包涵体蛋白的形成原因是多方面的。造成本实验结果的原因可能是由于昆虫基因利用原核表达系统表达，使得该外源基因表达过程中对表达细胞产生一定的毒性，从而以不可溶的包涵体形式存在。

本研究明确了兰州熊蜂SMPD基因原核表达的最佳诱导温度、诱导剂浓度及诱导时间分别为10℃、0.1 mM和32 h。利用优化的原核表达条件，可以获得大量目的蛋白，为后续蛋白纯化、抗体制备及深入开展SMPD基因在兰州熊蜂表达特性及功能研究奠定了基础。

图2 诱导温度与诱导剂浓度对目的蛋白表达量影响

图3 诱导时间对目的蛋白表达量影响

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Optimization of inducing conditions for prokaryotic expression of SMPD gene from Bombus lantschouensis

Han Lei1,2,Dong Jie2,Huang Jiaxing2,He Shaoyu1,Wu Jie2
(1 Eastern Bee Research Institute,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201，China;2 Key Laboratory for Insect-Pollinator Biology of the Ministry of Agriculture,Institute of Apicultural Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100093，China)

Bombus lantschouensis is an excellent pollinator for greenhouse crop in China.Sphingomyelin phosphodiesterase（SMPD）is a hydrolase enzyme that is involved in sphingolipid metabolism reactions.To increase the expression level of the SMPD protein in E.coli BL21 (DE3),the prokaryotic expression conditions of inducing temperature,IPTG concentration and incubation time were optimized.Results indicated that inducing temperature and time were the main factors affected the expression level of SMPD protein.However,the concentration of IPTG contributed to the express level very few.The optimized conditions for the highest expression level of the target protein are as follows:inducing temperature at 10℃，IPTG concentration is 0.1 mM and incubation time is 32 h.The current study provides a basic knowledge for studying the role of SMPD protein in Bombus lantschouensis in future.

Bombus lantschouensis;prokaryotic expression;SMPD gene;inducing conditions

韩蕾（1992-），女，在读硕士，E-mail:hanlei2016@126.com

和绍禹（1952-），男，教授，博士生导师，E-mail:kmhsy@163.com；吴杰（1962-），男，博士生导师，E-mail:apis@vip.sina.com