猪伪狂犬病毒变异株AH02LA单因子发病模型的建立

毛爱民，范 锋，王继春，冯志新，华利忠，刘剑锋

（1. 无锡市动物疫病预防控制中心，江苏无锡 214016；2. 江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京 210014；3. 南京农业大学，江苏南京 210014）

猪伪狂犬病毒变异株AH02LA单因子发病模型的建立

毛爱民1，范 锋1，王继春2，冯志新2，华利忠2，刘剑锋3

（1. 无锡市动物疫病预防控制中心，江苏无锡 214016；2. 江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京 210014；3. 南京农业大学，江苏南京 210014）

2011年以来，猪伪狂犬病毒（PRV）变异株在我国多地区流行，造成了严重的经济损失。本研究以主要猪病病原为阴性的仔猪为基础，建立了PRV变异株AH02LA单因子发病模型，并研究了其主要病理学变化。研究发现PRV会引起仔猪非化脓性脑炎，这一病理变化将有助于猪伪狂犬病的临床快速准确诊断。

猪伪狂犬病毒；变异株；发病模型；病理学；猪

猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR），也叫奥耶兹氏病（Aujeszky's disease，AD），是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病[1]。2011年以来，PR在我国部分地区暴发流行，给我国养猪业造成严重经济损失[2-3]。很多研究表明，目前在我国流行的PRV毒株为变异株[4]。高通量测序表明这些变异株处于一个相对独立的分支，为Ⅱ型PRV，有别于传统的Ⅰ型PRV[5]，这是引起此次PR暴发的主要原因。研究显示，新型PRV在致病性方面与传统的PRV相比，其致病力明显增强，感染猪发病更快，临床症状和病理变化更强[6]。然而目前所有关于新型PRV的致病性研究都是基于临床发病猪或普通猪的人工发病模型，无法避免其他病原导致的影响。本研究以主要猪疫病病原全阴性猪为基础，建立了新型PR发病模型，并研究其病理组织学变化，为新型PRV的致病性研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

1.1.1 主要试剂。PRV gB抗体ELISA检测试剂盒、PRV gE抗体ELISA检测试剂盒、猪瘟（CSF）抗体ELISA检测试剂盒、猪高致病性蓝耳病（PRRS）抗体ELISA检测试剂盒和猪肺炎支原体（MHP）抗体ELISA检测试剂盒，均购自美国IDEXX生物科技有限公司；猪圆环病毒2型（PCV2）抗体ELISA检测试剂盒、猪O型口蹄疫（FMD-O）抗体检测试剂盒，均购自韩国金诺（JBT）公司；PCR试剂，购自天根生物技术有限公司。其他所用试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.2 主要仪器。PCR仪（美国PE公司）；Kodak凝胶成像系统（美国Kodak公司）；组织切片机（德国Leica公司）；DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶标仪（芬兰 Thermo公司）；PYX-DHS数显隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；TGL-168离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 病毒

PRV变异株AH02LA，病毒含量为 107.1TCID/mL，由国家兽用生物制品工程技术研究中心分离鉴定，制备批号为20141009，-70 ℃保存。

1.3 试验动物及处理

未吃乳的6周龄健康仔猪10头，品种为外三元，根据Huang等[7]的方式培育所得，由江苏省农业科学院兽医研究所提供，未进行任何疫苗免疫。所有仔猪经商品化试剂盒检测，其PRV gB、PRV gE、PRRSV、CSFV、PCV2、MHP和FMD血清抗体均为阴性。将10头仔猪随机分为2组，每组5头。试验组通过鼻腔攻毒和肌肉注射PRV变异毒株AH02LA（攻毒剂量为107.1TCID/mL，鼻腔和肌肉注射各1 mL/头）。攻毒后，每天检查猪只体温和临床症状。

1.4 剖检及病理学分析

试验组仔猪死亡后，立即对其剖检，对照组仔猪在攻毒后第8天，对其实施统一剖检；记录所有脏器的肉眼变化，并采集肺脏、肝脏、脾脏、扁桃体、淋巴结、大脑等组织样品，用中性福尔马林固定，进行常规石蜡切片制作，HE染色，镜检。

1.5 病原检测

取试验组仔猪的扁桃体和脑组织，用常规方法提取病毒DNA，按彭金美等[8]的PCR方法鉴定PR病原。

2 试验结果

2.1 临床表现

试验组所有仔猪在接种PRV变异毒株AH02LA后第3天体温开始升高，达到或超过40.5 ℃，其中有1头猪出现PR临床症状，表现为精神沉郁、食欲减退、咳嗽、打喷嚏；到第5天，所有试验仔猪出现典型PR临床症状，体温普遍超过41 ℃，最高的达到42.1 ℃。除上述临床症状外，还出现呼吸困难、共济失调和惊厥现象，并首次出现死亡；到第7天，所有试验猪全部死亡。在整个试验过程中，对照组仔猪体温没有明显变化，也没有明显临床症状。

2.2 肉眼病理变化

试验组仔猪的肉眼明显变化主要有：脑组织水肿、充血（图1A）；肾脏有红色针尖状出血点（图1B），有的肿大，出现黄疸；扁桃体出血（图1C），两头有溃疡；肝脏出现白色针尖状坏死点（图1D）；肺脏出血、水肿（图1E）；淋巴结肿大出血（图1F）。

2.3 病理组织学变化

取病变组织，常规石蜡切片，HE染色，镜检。结果显示：对照组猪肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结和脑等组织基本正常，无异常病理变化。试验组仔猪主要病变为：肝脏门静脉、汇管区以及窦状隙淤血，并伴有肝小叶大量出血，干细胞变性坏死（图2A）；肺脏的肺泡内大量出血，肺间质增宽（图2B）；脑组织呈现噬神经元现象等非化脓性脑炎典型病变（图2C）；脾脏的淋巴细胞缺失，有坏死灶（图2D）。

图1 PRV变异株AH02LA感染猪的肉眼变化

图2 PRV变异株AH02LA感染猪的显微病变（HE，×10）

2.4 病原检测

取猪鼻拭子、脑组织以及扁桃体样品进行PCR检测，结果在5头试验猪的脑组织和扁桃体中均能检测到PR病原，而对照组全为阴性。

3 讨论

新PRV变异株感染主要表现为仔猪出生后有腹泻和神经症状，病死率较高。Gu等[9]采用PRV新变异株ZJ01的对不同日龄实验猪的致病性进行了验证，结果发现该毒株不仅能引起24日龄断奶仔猪100%死亡，还能引起80～85日龄猪100%死亡，证明PRV ZJ01分离株毒力增强。本实验采用主要猪病病原均为阴性的断奶仔猪进行PRV变异毒株AH02LA攻毒试验，发现该变异株感染仔猪3天后就可观察到典型PR临床症状，且5天内可致部分猪死亡，7天后可致所有感染猪死亡。这一结果与王继春等[10]采用同样的PRV毒株感染临床健康猪所观察到的临床症状及死亡情况一致，也与Gu等[9]的研究结果一致，说明PRV变异毒株AH02LA毒力超强。

Wu等[11]在我国东北等地区开展PRV调查，发现PRV感染的主要病变为肺脏坏死、肾脏和淋巴结出血、扁桃体坏死和脾脏淋巴细胞缺失等。这些变化在临床上容易误诊为高致病性猪蓝耳病和猪瘟，因此增加了PR的临床快速诊断难度。本研究采用主要猪病病原均为阴性的断奶仔猪进行PR病理学研究，发现PRV变异毒株AH02LA所造成的病理学变化主要为：脑组织水肿、充血；肾脏有红色针尖状出血点，扁桃体出血；肝脏出现白色针尖状坏死点；肺脏出血，淋巴结肿大、出血；脾脏出现红色坏死灶。该结果与高致病性蓝耳病及猪瘟的大部分临床表现相似，依然难以区分。但PRV会引起非化脓性脑炎，主要表现为中枢神经症状，病变特征为灰质和白质的非化脓性脑膜脑炎和神经节炎：血管套以单核细胞为主，有少量粒细胞；单核细胞通常发生明显的核固缩和核碎裂；神经元灶性坏死，周围聚集有单核细胞或病变神经元的散在分布[12-14]。这一病理变化有助于PR的临床快速准确诊断。

[1] JEFFREY J Z，LOCKE A K，KENT J S，et al. 10th Disease of swine[M]. USA：John Wiley＆ Sons， Inc，2012：1534-1625.

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[9] GU Z，HOU C，SUN H，et al. Emergence of highly virulent pseudorabies virus in southern China[J]. Can J Vet Res， 2015，79（3）：221-228.

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[11] WU R，BAI C Y，SUN J Z，et al. Emergence of virulent pseudorabies virus infection in Northern China[J]. J. Vet. Sci，2013，14（3）：363-365.

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（责任编辑：朱迪国）

Establishment of Pseudorabies Model Induced by Single Factor of PRV Variant（AH02LA Strain）

Mao Aimin1，Fan Feng1，Wang Jichun2，Feng Zhixin2，Hua Lizhong2，Liu Jianfeng3

（1. Wuxi Animal Disease Prevention and Control Center，Wuxi，Jiangsu 214016；2. Institute of Veterinary Medicine of Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology，National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products of MoA，Nanjing，Jiangsu 210014，3. Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210014）

Since 2011，variants of Pseudorabies virus（PRV）have been widely prevalent in many areas of China，causing severe economic loss. In this study，a single factor infection model of PRV was established by using the variant PRV strain AH02LA and negative piglets（piglets without most pathogens of swine diseases），and its pathological changes were studied. Results showed PRV infection could cause non-suppurative encephalitis of piglets，the study would provide reference for rapid and accurate diagnosis of PR.

Pseudorabies virus；variant strain；infection model；pathology；pigs

S851.3

B

1005-944X（2017）04-0086-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.04.025

江苏省农业三新工程项目“生猪伪狂犬病综合防控技术的推广应用”（SXGC[2015]024）