重组人血管内皮抑素联合紫杉醇化疗对人乳腺癌MDA—MB—435细胞抗凋亡基因Bcl—2的影响

姜秋颖++金英华++张冉冉++陈春红++黄大勇++吕艳菊++信涛++申维喜

[摘要] 目的 探討重组人血管内皮抑素（恩度）联合紫杉醇对人乳腺癌MDA-MB-435细胞抗凋亡基因Bcl-2的影响。 方法 将BALB/c裸鼠32只进行细胞培养，随机分为4组，其中3个化疗组（恩度组、紫杉醇组及恩度联合紫杉醇组）和1个对照组，每组8只。化疗组为腹腔注射给药，第1、8天各给药1次，给药剂量：恩度10 mg/kg、紫杉醇注射液10 mg/kg。对照组腹腔注射生理盐水，第1、8天各注射1次。给药15 d后处死小鼠并取出瘤体，将瘤体组织行HE染色和免疫组化SP法染色。原位末端标记法检测细胞凋亡，并计算癌细胞凋亡指数（AI）。 结果 恩度组、紫杉醇组及恩度联合紫杉醇组Bcl-2表达均显著低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。恩度联合紫杉醇组Bcl-2表达分别显著低于恩度组、紫杉醇组，差异有统计学意义（P < 0.05）。恩度组、紫杉醇组及恩度联合紫杉醇组AI均显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。恩度联合紫杉醇组AI分别显著高于恩度组、紫杉醇组，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 抗凋亡基因Bcl-2可能参与了乳腺癌的发生、发展过程，恩度联合紫杉醇化疗可降低Bcl-2表达，促进乳腺癌细胞凋亡，因此，Bcl-2水平检测在恩度联合紫杉醇治疗乳腺癌效果及预后评估中有重要的参考价值。

[关健词] 乳腺癌；抗凋亡基因Bcl-2；恩度联合紫杉醇；化疗

[中图分类号] R655.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（b）-0092-04

Influence mechanism of Endostar combined with Paclitaxel on human breast cancer MDA-MB-435 cell apoptosis gene Bcl-2

JIANG Qiuying JIN Yinghua ZHANG Ranran CHEN Chunhong HUANG Dayong LU Yanju XIN Tao SHEN Weixi▲

Internal Medicine-Oncology， the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University， Heilongjiang Province， Harbin 150086， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of Endostar combined with Paclitaxel anti apoptosis gene Bcl-2 on human breast cancer cell line MDA-MB-435. Methods 32 BALB/c mice were cultured and randomly divided into four groups， 3 chemotherapy groups （Endostar group， Paclitaxel group and Endostar combined with Paclitaxel group） and 1 control group， 8 rats in each group. Chemotherapy groups were given intraperitoneal injection，at the first and eighth days respectively administered 1 times. Dosage： Endostar 10 mg/kg， Paclitarel injection 10 mg/kg. Control group received intraperitoneal injection of normal saline， at the first and eighth days respectively administered 1 times. After treatment for 15 d， mice were killed and the tumors were removed， HE staining and immunohistochemical SP staining were performed in the tumor tissues. Apoptosis was detected by TUNEL method， and the apoptosis index （AI） of the cancer cells was calculated. Results The expression of Bcl-2 in Endostar group， Paclitaxel group and Endostar combined with Paclitaxel group was respectively significantly higher than that of the control group， the difference was significant （P < 0.05）. And the expression of Bcl-2 in Endostar combined with Paclitaxel group was significantly higher than that of Endostar group， Paclitaxel group respectively， the difference was significant （P < 0.05）. The AI of Endostar group， Paclitaxel group and Endostar combined with Paclitaxel group was respectively significantly higher than that of the control group， the difference was significant （P < 0.05）. And AI of Endostar combined with Paclitaxel group was significantly higher than that of Endostar group， Paclitaxel group respectively， the difference was significant （P < 0.05）. Conclusion The anti apoptotic gene Bcl-2 is involved in the development and progression of breast cancer， combined with Paclitaxel chemotherapy for apoptosis of breast cancer patients by monitoring the expression of anti apoptosis gene Bcl-2 in breast cancer combined with Paclitaxel in chemotherapy， favorable for curative effect and prognosis evaluation provides an important theoretical basis.

[Key words] Breast cancer； Anti apoptosis gene Bcl-2； Endostar combined with Paclitaxel； Chemotherapy

肿瘤的发生机制比较复杂，研究证实细胞凋亡障碍是肿瘤发生、发展的重要机制之一[1]。Bcl-2基因是Bcl-2家族中重要的抗细胞凋亡基因，研究发现其参与了肿瘤细胞的凋亡过程，具有抑制细胞凋亡、调控细胞增生、延长细胞寿命等作用，参与了许多肿瘤如肺癌、食管癌、乳腺癌的发生发展过程[2]。乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率逐年升高。乳腺癌传统的治疗方法有手术、放疗和化疗。随着对乳腺癌生物行为学的认识，化疗在乳腺癌的治疗中发挥越来越重要的作用，有效的化疗药物能显著提高患者的生存质量。但也存在复发的现象，且复发后的乳腺癌细胞还可能会对化疗产生耐受性，因此，开发新的化疗药物或增强现有药物的疗效成为目前肿瘤治疗的研究热点。重组人血管内皮抑素（恩度，Endostar/YH-16）是我国学者自主创新研发的新型人血管内皮抑素，具有广谱的抗血管生成活性，其通过抑制形成血管的内皮细胞迁移及抑制肿瘤新生血管生成，进而抑制肿瘤增殖或转移[3]。紫杉醇为常用治疗乳腺癌的化疗药物之一，国内外已有研究表明紫杉醇能诱导肺癌、食管癌、乳腺癌等恶性肿瘤细胞凋亡[3]。有研究显示，提高化疗诱导细胞凋亡水平，可提高肿瘤对化疗的反应；促进细胞凋亡是抗肿瘤治疗的重要机制[4]。本实验通过细胞培养及免疫组化原位末端标记法（TUNEL）检测Bcl-2在乳腺癌组织中的表达情况，分析应用恩度联合紫杉醇化疗对乳腺癌细胞抗凋亡基因Bcl-2的影响，旨在探讨恩度联合紫杉醇化疗诱导Bcl-2在乳腺癌细胞中过表达而发挥抗凋亡的作用机制，从而为临床治疗乳腺癌的不同化疗方案提供理论基础及科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物

选择BALB/c裸鼠32只，动物合格证号：0123008，饲养在清洁级实验环境下（动物设施合格证号：SYXK 1120020014）。雌性，4周龄，体重15～19 g，裸鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所生物技术国家重点实验室提供支持。

1.2 细胞培养及制造动物模型

将人乳腺癌MDA-MB-435细胞株（由我院实验室保存提供）置于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，添加100 U/mL青霉素及100 mg/L链霉素，37℃，5%CO2的条件下培养。取指数生长期约5×106/mL细胞传代及接种24孔板中，培养48 h后待用。取第3、4代培养细胞进行移植，经消化、清洗、染色，計数并调整使活细胞浓度为1×107/mL，于每只裸鼠右侧胸壁乳垫下接种0.1 mL制造裸鼠乳腺癌模型。

1.3 分组

于裸鼠皮下注射MDA-MB-435细胞，在普通无菌室的超净生物层流架中饲养，无菌操作，连续观察2周后开始治疗。将裸鼠随机分为3个化疗组（恩度组、紫杉醇组及恩度联合紫杉醇组）和1个对照组，每组8只。化疗方案：恩度、紫杉醇及两者联合化疗。化疗组腹腔注射给药，第1、8天各给药1次。对照组腹腔注射生理盐水，第1、8天各注射1次。每次给药剂量：恩度（先声药业，国药准字S20050088）10 mg/kg、紫杉醇注射液（江苏扬子江药业，国药准字H20058719）10 mg/kg。

1.4 免疫组化

各组裸鼠至给药15 d后脱颈处死，取出瘤体组织置于10%福尔马林中固定，常规石蜡包埋切片，4 μm厚连续切片，然后行HE染色和免疫组化SP法染色，备作免疫组化和TUNEL检测之用。鼠抗人Bcl-2单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。SP试剂盒购于福州迈新试剂公司；TUNEL检测试剂盒购自德国宝灵曼公司。参照免疫组化SP配套试剂盒说明进行。DBA显色，自来水终止显色反应。所有石蜡标本经切片厚度约4 μm，切片常规脱蜡至水，过氧化氢室温孵育51 min，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗。微波加热抗原修复，PBS冲洗。1∶50正常羊血清封闭20 min。加入PBS稀释的一抗，1∶100稀释生物素化二抗。临用前配制DAB显色试剂，室温30 min，自来水充分冲洗。苏木精衬染，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片，光学显微镜下观察实验结果。对照实验用PBS代替一抗作阴性对照，用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性标本作阳性对照。

1.5 结果判定

Bcl-2定位于细胞浆和细胞膜，为棕黄色或棕褐色。每例切片观察5～10个高倍视野（光镜，200×），以计数1000个肿瘤细胞中的阳性细胞百分比为标准[5]。

1.6 癌细胞凋亡指数（AI）

应用TUNEL法检测组织中的凋亡细胞，利用HMIAS 2000高清晰度彩色图文分析系统，每张切片选择10个高倍视域，数1000个肿瘤细胞。计算AI。AI=凋亡细胞数/癌细胞总数×100%[6]。

1.7统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间两两比较采用t检验，进行方差齐性检验，满足方差齐性应用单因素方差分析法进行多重比较方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

恩度组、紫杉醇组及恩度联合紫杉醇组Bcl-2表达均显著低于对照组，且恩度联合紫杉醇组Bcl-2表达显著低于恩度组、紫杉醇组，差异有统计学意义（P < 0.05）。恩度组、紫杉醇组及恩度联合紫杉醇组AI均显著高于对照组，且恩度联合紫杉醇组AI显著高于恩度组、紫杉醇组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

3 讨论

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率逐年增高，且日趋年轻化，已经成为影响人类健康的主要疾病。美国2010年癌症发病统计显示，乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌等均是女性患者发病率较高的恶性肿瘤，其中乳腺癌占28%[7]。尽管由于近些年来检测及治疗手段的提高大大降低了乳腺癌的死亡率，但无论是在发达国家还是发展中国家，乳腺癌依然是女性发病率及死亡率较高的肿瘤。

研究发现，乳腺癌的发生、发展过程可能与细胞凋亡调控失调密切相关[8]。细胞凋亡是在多种基因调控下进行的细胞程序性死亡。乳腺发生癌变时，机体启动凋亡抑制机制使正常细胞凋亡通路发生障碍[9]。当凋亡机制受各种因素的影响减弱甚至抑制时，增生细胞得以逃脱凋亡，使局部组织细胞继续增生，最终形成乳腺癌[10]。

Bcl-2基因族是抑制细胞凋亡重要因子，Bcl-2抗凋亡基因是Bcl-2家族中的重要成员，定位于染色体18q21上，全长约230 kb，该基因有3个外显子、2个启动子和2个内含子，编码239个氨基酸组成的相对分子质量为26 kD的Bcl-2蛋白[11]。在发生凋亡过程中，Bc1-2家族的促凋亡蛋白在凋亡相关因子激活下，易位到线粒体膜上，破坏线粒体完整性，释放线粒体内的促凋亡因子，经过细胞信号转导途径逐步放大，最终导致凋亡发生[12]。近些年Bcl-2已被广泛用于肿瘤病变的细胞凋亡方面的研究。越来越多的研究发现，Bcl-2与多种肿瘤病变的发生、发展密切相关，其表达与肿瘤的大小、肿瘤细胞的增殖程度、肿瘤的浸润性和预后密切相关[13]。Bcl-2基因参与了乳腺癌的发生和发展过程，检测乳腺癌组织中Bcl-2基因的表达有助于预测乳腺癌的组织学分级情况及预后[14]。随着对乳腺癌生物行为学的认识，化疗在乳腺癌的治疗中发挥越来越重要的作用，而许多研究证实，许多化疗药物都是通过诱导肿瘤细胞发生凋亡而达到治疗的目的，如阿糖胞苷、阿霉素、甲氨蝶呤、环磷酰胺等，且研究证实，Bcl-2基因高表达与乳腺癌细胞对这些药物产生耐药性密切相关[15-17]。Leyre等[18]研究发现，针对Bcl-2表达水平的治疗很有希望与常规的化疗、放疗一起成为乳腺癌治疗的重要手段。

恩度是一种新型靶向抗癌药物，研究证实，其具有抑制血管内皮细胞增殖、迁移、分化，促进内皮细胞凋亡的作用[19-20]。

紫杉醇为常用治疗乳腺癌的化疗药物之一，研究发现，紫杉醇及其衍生物通过抑制微管的解聚，打破微管聚合与解聚的动态平衡，抑制纺锤体形成，使细胞不能进行正常的分裂而停滞在G2期，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的作用[21]。研究发现，紫杉醇主要适用于卵巢癌和乳腺癌，其可与顺铂、卡铂、环磷酰胺、氟尿嘧啶、阿霉素、VP-16等联用[22]。于华楠等[17，23]研究发现，多西紫杉醇作为广谱抗肿瘤药物之一，对乳腺癌具有较好的疗效，其通过采用MTT比色法分析多西紫衫醇对人乳腺癌MCF-7肿瘤细胞的增殖作用，应用光镜、电镜分别进行细胞形态学及超微结构的观察；采用Annexirr V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率和周期变化，以及应用免疫组化方法檢测Bcl-2基因蛋白的表达变化，研究结果证实多西紫衫醇对人乳腺癌MCF-7细胞具有明显抑制生长的作用，并可进一步诱导细胞凋亡，其机制可能与调节Bcl-2等凋亡基有关。且洪雷等[24]研究也证实，两者联合作用时诱导凋亡作用增强。本研究结果也证实了上述观点，表1结果显示，三组Bcl-2表达分别显著低于对照组，AI分别显著高于对照组，而联合组Bcl-2表达分别显著低于恩度组、紫杉醇组，AI分别显著高于恩度组、紫杉醇组，组间比较差异具有统计学意义（P < 0.05），证实恩度联合紫杉醇化疗方案用于乳腺癌患者具有协同促凋亡作用，通过监测抗凋亡基因Bcl-2在乳腺癌行恩度联合紫杉醇化疗中的表达情况，有利于为评价疗效及预后提供重要的理论依据。

综上所述，抗凋亡基因Bcl-2可能参与了乳腺癌的发生、发展过程，恩度联合紫杉醇化疗可降低Bcl-2表达，促进乳腺癌细胞凋亡，因此，Bcl-2水平检测在恩度联合紫杉醇治疗乳腺癌效果及预后评估中有重要的参考价值。

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（收稿日期：2016-09-04 本文编辑：王红双）