四环素对斑马鱼胚胎发育及CAT和SOD活性的影响

梁伟放+赵建国++柳贤德

摘 要 抗生素在养殖业中的长期滥用，对水环境产生的污染问题日益受到关注。本研究采用5种不同梯度浓度（0，200，220，240，260，280 mg/L）的四环素溶液对斑马鱼胚胎进行处理，随后观察其在受精后144 h的死亡率和孵化率；將成年斑马鱼暴露于四环素溶液（400 mg/L）96 h，随后取其肝、肾、肌肉和脑，并分别测定这4类组织中过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。结果表明：四环素对斑马鱼胚胎发育有明显的毒性作用，并导致幼鱼的脊柱弯曲、鱼鳔萎缩甚至死亡；CAT酶在肌肉组织中显著升高，而SOD酶在肝脏组织中显著上升。鱼类肌肉中的CAT酶活性和肝脏中的SOD酶活性可成为水生生态抗生素污染的生物标记。

关键词 四环素 ；胚胎发育 ；CAT ；SOD

中图分类号 Q493

Effects of Tetracycline on Embryo Development and Enzymatic Activities of Zeb7rafish

LIANG Weifang ZHAO Jianguo LIU Xiande

（Department of Veterinary Medicine，Hainan University，Haikou，Hainan 570228）

Abstract Due to long-term abuse of antibiotics in aquaculture，environmental pollution of water is increased. Zebrafish embryo were exposed to different concentration（0，200，220，240，260，280 mg/L）of tetracycline solution，and then observed mortality and hatchability at 144 hpf. Adult zebrafish were exposed to tetracycline solution（400 mg/L）for 96 hours and removed the liver，kidney，muscle，and brain. The catalase（CAT）and superoxide dismutase（SOD）activity were determined in liver，kidney，muscle，and brain. Results indicated that tetracycline toxic to zebrafish embryos，and inducedspinal curvature and swim bladder atropy inzebrafish larve. CAT activity was significantly increased in muscle and SOD activity was slightly increased in liver. Therefore，CAT activity of muscle and SOD activity of liver may become to biomarker for tetracycline pollution of aquatic environment.

Key words tetracycline ；embryo development ；CAT ；SOD

抗生素由于能促进动物生长和增产，在养殖业中以亚治疗剂量被长期添加于动物饲料中。目前，世界上生产的抗生素已达200多种，其中至少有50 %的抗生素用于蓄牧业、养蜂业和水产养殖业[1]。抗生素进入生物体后，并不被完全吸收，其中85 %以上以原药形式排出体外，有些抗生素在生物体内经生物转化，生成毒性更强的代谢物随粪便和尿液排出体外[2]。这些抗生素及其代谢物随雨水、地表径流污染地表水，或通过渗滤作用污染地下水[3]。由于在水产和家畜养殖中长期频繁的使用抗生素，对水生生态系统和人体健康构成极大的潜在威胁[4]。

本研究选取四环素作为目标化合物，分析四环素对斑马鱼胚胎的孵化率和死亡率的影响，从而评价四环素对水生生物的毒性等级及其生态风险。此外，还分析了四环素对斑马鱼成鱼的肝、肾、肌肉和脑中CAT和SOD含量的影响，为水生物的生物标记物挖掘提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

盐酸四环素（Sigma-Ardrich Co. LLC，USA）、BCA法蛋白定量测试盒（南京建成生物科技有限公司）、CAT试剂盒（南京建成生物科技有限公司）、SOD试剂盒（南京建成生物科技有限公司）。

1.1.2 设备及器材

ZKH-定制版四层单排斑马鱼养殖系统（青岛中科海水处理有限公司）、Moticam 2056体式显微镜（MOTIC CHINA GROUP CO.，LTD）、LRH-250F生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 方法

试验所用的斑马鱼胚胎和成年斑马鱼均自繁自养，采用专业的饲养系统正规饲养，水温维持在（28-29） ℃，pH为7.0-7.5，溶氧量≥6.0 mg/L，光照周期为14/10 h（昼/夜）。所有试验过程中，保证满足上述温度和水质条件。

1.2.1 胚胎毒性试验

用胚胎培养液将盐酸四环素配制0、200、220、240、260、280 mg/L等6个梯度浓度，用NaHCO3把pH调整为7.0，并依次装入6孔板中，每孔含8 mL的四环素溶液；于受精后1-2 h内选取正常一致的胚胎，每孔放入30-40胚胎，置于28.5 ℃的恒温培养箱中培养；4 hpf（hours post fertilization）从每孔中选出发育正常的胚胎置于装有2 mL四环素溶液的24孔板中，每孔放5个胚胎，每板设置20孔为四环素培养液实验组，剩下4孔为胚胎培养液空白对照组（试验成立标准：空白对照组致死率≤16 %）；每2 h换1次培养液，记录144 hpf的孵化率和死亡数，并使用体式显微镜观察斑马鱼胚胎在发育过程中的形态学变化。

1.2.2 成鱼毒性试验

将雌、雄各半且长度及年龄相同的成年斑马鱼暴露于400 mg/L四环素溶液中，处理96 h；将40条斑马鱼分成4组，每组10条，其中3组用400 mg/L四环素溶液处理，剩下1組作为对照组；96 h后，将各组斑马鱼解剖，并分别摘取其肝、肾、肌肉、脑4类组织，称重，匀浆，配制成10 %组织匀浆，于4 ℃离心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 CAT和SOD酶活性测定

CAT和SOD酶活性按照试剂盒的操作方法进行测定。

1.3 数据处理

所得数据用 SPSS（19.0版）软件进行统计，并用 GraphPadPrism 5 作图。

2 结果与分析

2.1 胚胎毒性试验结果

将斑马鱼胚胎暴露于6个不同梯度（0、200、220、240、260、280 mg/L）的四环素溶液中，观察144 hpf的死亡率和孵化率。结果表明，相比胚胎发育前期，后期的四环素毒性作用更为明显；斑马鱼胚胎死亡率随四环素浓度的剂量的加大而呈上升趋势，260和280 mg/L处理组的大部分胚胎死亡（图1-A）；斑马鱼孵化率在240 mg/L处理组中显示为最低，但260和280 mg/L处理组反而有上升的趋势，这主要是由于计算过程中剔除了大量死胚而导致的（图1-B）。

除了提高死亡率和降低孵化率之外，抗生素还能导致胚胎的畸形，如脊柱弯曲、鱼鳔萎缩。在144 hpf，随四环素浓度的升高，脊椎弯曲和鱼鳔萎缩的幼鱼比率也随之上升（图2）。

2.2 酶活性测定试验结果

为了寻找合适的生物标志物，分别在肝、肾、肌肉、脑4类组织中检测了CAT和SOD酶活性。相比对照组， CAT活性在四环素处理组中都有升高，但与其它组织相比，其在肝组织中活性的提高幅度最为显著（图3-A）。经四环素处理后，肌肉和脑部中的超氧化物歧化酶（SOD）活性都有提高，但其在肝脏中的活性变化幅度相比其他组织更为明显（图3-B）。因此，通过鱼类对水体中的四环素污染进行监控时，肝脏中CAT和肌肉中SOD活性升高均可作为水体污染的依据。

3 结论

目前，关于抗生素对水生生物的毒性研究主要集中在细菌[5]、藻类[6]和甲壳类[7]。斑马鱼具有个体小、产卵多、体外受精、发育快、胚胎透明、易于观察、饲养简便等优点，越来越受到环境毒理学家们的青睐[8]。Oliveira等[9]分析了四环素和阿莫西林对斑马鱼胚胎的影响，结果显示，抗生素对斑马鱼胚胎发育具有显著的毒性，成鱼的头部、肌肉、鱼鳃、肝的CAT、GST、LDH等活性均具有显著差异。

抗生素广泛应用于养殖业，随动物的排泄物严重污染水生生态系统。四环素作为养殖业中使用最广泛的抗生素，对斑马鱼的生长发育具有较大的毒性，可导致幼鱼脊柱弯曲和鱼鳔萎缩，高浓度或长时间暴露时可引起死亡。四环素显著提高成鱼肝脏CAT和肌肉SOD活性，可作为水体抗生素污染的生物标志物。

参考文献

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