马氏珠母贝肉酶解条件优化及其产物活性分析

付晶晶　张艳雯　吴耀生　孙健

摘要：【目的】優化超声波辅助酶解马氏珠母贝肉工艺条件，并对酶解产物进行自由基清除活性分析，为马氏珠母贝肉的高值化利用提供参考依据。【方法】以马氏珠母贝肉为原料，采用单因素及响应面试验分析酶解温度、加酶量、超声功率和酶解时间对珠母贝肉蛋白质水解度的影响，确定最佳工艺参数，并测定酶解产物对羟基自由基（·OH）、超氧自由基（ ）及DPPH自由基（DPPH·）的清除能力。【结果】影响马氏珠母贝肉酶解效果的4个因素主次顺序为：超声波功率>加酶量>酶解温度>酶解时间，其中酶解温度、加酶量和超声波功率影响极显著（P<0.01），酶解时间及加酶量与超声波功率的交互作用影响显著（P<0.05）。马氏珠母贝肉最佳超声波辅助酶解条件为：酶解温度48 ℃、加酶量2200 U/g、超声波功率13%（总输出功率900 W）、酶解时间12 min，在此条件下的蛋白质水解度为21.937%，与预测值（22.140%）的相对误差为0.92%。酶解产物对·OH、 和DPPH·的清除能力随酶解产物质量浓度的增加而增强，当质量浓度为2.0 mg/mL时，清除率分别为68.85%、83.62%和82.36%。【结论】优化得到的超声波辅助酶解马氏珠母贝肉工艺参数准确可靠，酶解时间显著缩短，酶解产物具有明显的清除自由基活性，可作为具有抗氧化作用的保健食品、保健酒等产品的优质原料。

关键词： 马氏珠母贝肉；超声波辅助酶解；响应面法；清除自由基活性

中图分类号： TS254.9 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）01-0119-08

Abstract：【Objective】The present study optimized ultrasonic-assisted enzymolysis conditions for Pinctada fuctada martensii muscle， and analyzed free radical scavenging activity of enzymatic hydrolysate， in order to provide reference for value-added utilization of P. fuctada martensii muscle. 【Method】P. fuctada martensii muscle was taken as the material， single factor and response surface methodology were applied to analyze effects of enzymolysis temperature， protease dosage， ultrasonic power and enzymolysis time on degree of hydrolysis（DH） of protein in P. fuctada martensii muscle， and determine the optimum process parameters， and measure scavenging activity of enzymatic hydrolysate on hydroxyl radical（·OH）， superoxide radical（ ） and DPPH free radical（DPPH·）. 【Result】The factors influencing enzymolysis of P. fuctada martensii muscle in order of their effects were as follows： ultrasonic power>protease dosage>enzymolysis temperature>enzymolysis time. Enzymolysis temperature， protease dosage and ultrasonic power had extremely significant difference on enzymolysis（P<0.01）， and interaction between ultrasonic power and enzymolysis time had significant difference（P<0.05）. The optimal enzymolysis condition was as follows： enzymolysis temperature was 48 ℃， protease dosage 2200 U/g， ultrasonic power 13%（total output power was 900 W）， enzymolysis time 12 min. Under such condition， DH of protein was 21.937%， the relative error to expected value（22.140%） was 0.92%. The scavenging activity of enzymatic hydrolysate on ·OH， and DPPH· enhanced as mass concentration of enzymatic hydrolysate increased. When the mass concentration of enzymatic hydrolysate reached 2.0 mg/mL， the scavenging rate for ·OH was 68.85%， scavenging rate for 83.62% and scavenging rate for DPPH· 82.36%. 【Conclusion】The optimized process parameters of ultrasound-assisted enzymolysis are accurate and reliable. Enzymolysis time is shortened and free radical scavenging activity of enzymatic hydrolysate is obvious. Therefore， the enzymatic hydrolysate can be utilized as raw materials of health care food， health care drinks with antioxidation.

Key words： Pinctada fuctada martensii muscle； ultrasonic-assisted enzymolysis； response surface methodology； free radicals scavenging activity

0 引言

【研究意义】马氏珠母贝（Pinctada fuctada martensii）又称合浦珠母贝，主要分布在广西、广东和台湾海峡南部沿海一带，是我国海水珍珠的主要母贝（吴燕燕等，2015），由其生产的珍珠被称为南珠。近年来，我国南珠年产量在15～30 t（曹占旺，2011），珠母贝采珠后会产生大量贝肉，按珍珠及贝肉的比例估算，采珠后的贝肉每年为2000～4000 t（章超桦等，2000）。目前我国取珠后剩余的珠母贝肉小部分鲜销或初加工食用，还有一部分作为饲料原料廉价销售，其他则直接当作废弃物，致使贝肉的大部分营养成分尚未得到充分利用，还会造成环境污染（谢莉萍等，2000）。马氏珠母贝肉是一种营养丰富的产品，其蛋白质含量达81.2%（干基），高于其他常见贝类，且氨基酸种类齐全，含有18种以上常见氨基酸（刁石强等，2000）；多不饱和脂肪酸DHA和EPA的含量较高（方富永等，2007），并富含维生素及多种微量元素。因此，研究马氏珠母贝肉的深加工技术，对增加其附加值具有重要意义。【前人研究进展】为更好地利用马氏珠母贝肉资源，不少学者以其或水解产物为主要原料进行了一系列食品的研制，如软罐头（张静等，2008）、调味基料（陈美花等，2010）、烘烤贝肉（姜秋焕等，2012）、调味酱（郑惠娜等，2012）等，但这些只是附加值较低的初加工产品。对马氏珠母贝肉活性物质深层次的研究主要集中在活性肽和糖胺聚糖两方面。艾春媚等（2004）研究表明珠母贝糖胺聚糖对体外培养的新生大鼠颅骨成骨细胞有显著促进分化和矿化作用，但不能促进细胞增殖；胡雪琼等（2013）研究表明珠母贝糖胺聚糖具有一定的抗肿瘤作用。由于马氏珠母贝肉中活性肽的含量高于糖胺聚糖，因此具有较好的深加工潜力。但马氏珠母贝肉活性肽在贝肉内含量低，只有通过蛋白酶水解母体蛋白质，才能获得大量具有生物活性的肽制品。郝记明等（2007）利用蛋白酶对马氏珠母贝肉进行酶解，结果表明，经4～6 h酶解，产物表现出血管紧张素转换酶抑制剂活性；Wu等（2013）同样利用蛋白酶酶解马氏珠母贝肉蛋白，研究珠母贝肉酶解最佳工艺及其抗氧化活性，结果表明，经3 h酶解，水解度为31.2%，此时酶解产物在体内外均表现出较强的抗氧化活性；邓志程（2015）采用多酶水解的方式对马氏珠母贝肉进行处理，结果表明，3种蛋白酶同时处理3.5 h，活性肽得率可达55%，酶解产物可极显著增强经抗原诱导的小鼠免疫应答能力。但在这些研究中，均需进行较长时间的酶解才能获得活性肽，为提高酶解效率，一些强化方式如超声被应用于酶解过程。尚军等（2009）利用响应面法优化超声波辅助酶解合浦珠母贝肉的工艺条件，发现在超声波功率160 W、50 ℃条件下处理17 min后再酶解1 h，其水解度为31%；吴燕燕等（2011）利用相同的工艺条件对合浦珠母贝肉进行超声波辅助酶解，并对酶解产物清除自由基能力进行测定，结果表明，合浦珠母贝肉抗氧化肽对DPPH自由基（DPPH·）和羟基自由基（·OH）的清除率分别为77.7%和33.5%。【本研究切入点】超声分为发散式和聚能式两种，二者产生超声波的方式存在本质差别，聚能式超声波的换能器可与反应液直接接触，具有更强的超声强度。已有的相关研究均采用发散式超声波进行酶解，但鲜见利用聚能式超声波辅助酶解马氏珠母贝肉及其酶解产物清除自由基活性的相关报道。【拟解决的关键问题】在单因素试验的基础上，采用响应面法优化蛋白酶水解马氏珠母贝肉的工艺条件，并通过自由基清除能力體系评价酶解产物的体外抗氧化活性，以获得具有较高活性的抗氧化肽，为马氏珠母贝肉的进一步开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

马氏珠母贝购于广西合浦，开珠后取新鲜贝肉，冻藏备用。木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司。茚三酮、甘氨酸等试剂均为国产分析纯。主要仪器设备：UV- 9100紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）；TDL-5-A离心机（上海安亭科学仪器厂）；JY92- DN超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技有限公司）；DK-S24型恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；FE20 pH计（梅特勒—托利多公司）；UV- 2802s分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 马氏珠母贝肉酶解 马氏珠母贝肉解冻，经组织捣碎匀浆机破碎后进行超声辅助酶解，沸水浴灭酶，离心后测定蛋白质水解度。

1. 2. 2 蛋白质水解度测定 采用茚三酮显色法测定马氏珠母贝肉蛋白质水解度（赵新淮和冯志彪，1994）。其中，根据谢丽蒙等（2013）的方法计算得到马氏珠母贝肉htot为7.85 mmol/g，涉及的马氏珠母贝肉样品中氨基酸含量数据来源于郝记明（2005）的研究结果。

1. 2. 3 最适蛋白酶选择 加酶量为4000 U/g，在各种酶的最适反应条件下（表1）对马氏珠母贝肉进行酶解，酶解时间1 h，测定不同蛋白酶酶解后的蛋白质水解度。根据结果筛选出对马氏珠母贝肉酶解效果最佳的蛋白酶。

1. 2. 4 单因素试验 考察不同酶解温度（40、45、50、55和60 ℃）、加酶量（1000、1500、2000、2500和3000 U/g）、超声波功率（0、5%、10%、15%、20%和25%）（超声波细胞破碎仪输出功率900 W，试验超声波功率参数用输出功率的百分数表示）及酶解时间（6、8、10、12和14 min）对1.2.3选择的蛋白酶水解马氏珠母贝肉的影响。酶解结束后，沸水浴10 min灭酶，测蛋白质水解度。

1. 2. 5 响应面优化试验 在单因素试验的基础上，选取每个因素中较优的3个水平进行响应面设计，共29个试验点（5个中心点），以优化蛋白酶水解马氏珠母贝肉条件。响应面试验设计因素与水平见表2。

1. 2. 6 清除自由基活性测定 将马氏珠母贝肉酶解产物减压浓缩后用无水乙醇调节醇浓度至80%，静置1 h后离心，上清液减压浓缩后进行冷冻干燥。参照Yao等（2011）的方法，将干燥产物分别进行·OH、超氧自由基（ ）和DPPH·清除试验。

1. 3 统计分析

所有试验均重复3次，取平均值。对单因素试验数据进行One-way ANOVA方差分析，采用Design Expert 8.0.5对响应面试验结果进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 单因素试验结果

2. 1. 1 最适蛋白酶的选择 由图1可知，4种蛋白酶对马氏珠母贝肉酶解效果差异显著（P<0.05，下同），以中性蛋白酶对马氏珠母贝肉的蛋白质水解度最高，极显著高于其他3种蛋白酶的水解度（P<0.01，下同）。为了能短时间内获得较好的酶解效果，故选择中性蛋白酶作为单因素及响应面试验的蛋白水解酶；中性蛋白酶的最适pH为7.0，因此后续试验酶解过程均调节pH为7.0。

2. 1. 2 酶解温度对马氏珠母贝肉蛋白质水解度的影响 由图2可知，在固定加酶量2000 U/g、超声波功率15%、酶解时间10 min的条件下，酶解温度为40～45 ℃时，随着酶解温度的升高，马氏珠母贝肉蛋白质水解度显著增加；酶解温度为45～60 ℃时，随着酶解温度的升高，蛋白质水解度逐渐降低，可能是高温会使酶的活性降低。因此，选取酶解温度40、45和50 ℃ 3个水平进行响应面试验。

2. 1. 3 加酶量对马氏珠母贝肉蛋白质水解度的影响 由图3可知，在固定超声波功率15%、酶解温度50 ℃、酶解时间10 min的条件下，加酶量为1000～2000 U/g时，随着加酶量的增加，马氏珠母贝肉蛋白质水解度迅速增加，超过2000 U/g后，加酶量对蛋白质水解度无显著影响（P>0.05）。其原因可能是蛋白酶浓度较低时，其可与溶液中溶解的蛋白迅速结合并水解，但随着加酶量的增加，酶逐渐达饱和状态，水解效率趋于平缓。因此，选取加酶量1500、2000和2500 U/g 3个水平进行响应面试验。

2. 1. 4 超声波功率对马氏珠母贝肉蛋白质水解度的影响 由图4可知，在固定加酶量2000 U/g、酶解温度50 ℃、酶解时间10 min的条件下，超声波功率为0～15%时，马氏珠母贝肉蛋白质水解度随超声波功率的增大而不断增加，可能是超声波产生的空化效应释放巨大能量，破坏细胞结构，增强传质效率，使酶和底物的活性部位更易结合，从而增加反应速度，缩短反应时间（尚军等，2009）。但超声波功率超过15%后，蛋白质水解度有所降低，可能是由于聚能式超声波功率过高会破坏蛋白酶结构，此外超声波的热效应也对蛋白酶的活性有一定影响，从而降低蛋白质的水解度。因此，选取超声波功率10%、15%和20% 3个水平进行响应面试验。

2. 1. 5 酶解时间对马氏珠母贝肉蛋白质水解度的影响 由图5可知，在固定加酶量2000 U/g、超声波功率15%、酶解温度50 ℃的条件下，酶解时间为6～10 min时，随着酶解时间的延长，马氏珠母贝肉蛋白质水解度显著增加，在10～12 min时蛋白质水解度增速缓慢；酶解12～14 min时，随着酶解时间的延长，蛋白质水解度不再升高。其原因可能是超声波的剪切作用比较强烈，长时间超声会使酶结构遭受破坏。因此，选取酶解时间10、12和14 min 3个水平进行響应面试验。

2. 2 响应面分析法优化结果

2. 2. 1 回归方程的建立 利用Design Expert 8.0.5对响应面试验数据（表3）进行回归分析，得到蛋白酶水解马氏珠母贝肉的蛋白质水解度对各因素的回归模型方程：

Y=21.45+0.56A+0.88B-1.74C+0.28D+0.19AB+

0.058AC-0.024AD-0.45BC-0.26BD-0.045CD-

0.59A2-1.31B2-2.47C2-0.68D2

2. 2. 2 回归方程方差分析结果 表4为回归方程的方差分析和显著性检验。由表4可以看出，F=60.33，P<

0.0001，说明该模型有效可靠，达极显著水平，有意义。失拟项P=0.0992>0.05，不显著，表明对模型有利。回归模型R2=0.9837，说明该模型相关性较好，R2Adj=0.9674，说明该模型能解释96.74%响应值的变化。CV=1.74%，说明试验的可信度较高。精密度大于4为合理，本研究精密度=24.556，表明是一个适宜的信号。模型中A、B、C、A2、B2、C2、D2对试验结果影响达极显著水平， D、BC对试验结果影响达显著水平。由F可判断对蛋白质水解度影响的4个因素主次顺序为：超声波功率>加酶量>酶解温度>酶解时间。

2. 2. 3 响应面分析结果 通过Design Expert 8.0.5对因素间的交互作用进行响应面分析，得到各因素交互作用的响应面图（图6）。从图6可看出，各因素对响应值蛋白质水解度的影响均存在最大值，各因素在较低范围内随水平的增加，响应值逐渐增大；当响应值增大到极值后，随着因素水平的继续增加，响应值逐渐减小。在交互项对蛋白酶水解马氏珠母贝肉的影响中，加酶量与超声波功率对蛋白质水解度的交互效应最显著。由图6还可知，超声波功率对蛋白质水解度的影响最显著，曲线最陡峭；加酶量、酶解温度对蛋白质水解度的影响较显著，曲线较陡；而酶解时间对蛋白质水解度的影响最小，曲线较平缓，酶解时间的改变对响应值的变化影响较小。

2. 2. 4 验证试验结果 回归模型预测蛋白酶水解马氏珠母贝肉的理论最佳工艺条件为：酶解温度47.63 ℃、加酶量2213.13 U/g、超声波功率13.07%、酶解时间12.26 min，在此条件下，蛋白质水解度的理论值为22.140%。考虑到可操作性，将最优条件调整为：酶解温度48 ℃、加酶量2200 U/g、超声波功率13%、酶解时间12 min，通过3组平行试验进行验证，得到实际蛋白质水解度为21.937%，与理论值的相对误差为0.92%，说明模型准确可靠，对优化蛋白酶水解马氏珠母贝肉工艺具有实用价值。

2. 3 马氏珠母贝肉酶解产物清除自由基活性测定结果

为验证获得的马氏珠母贝肉酶解产物是否具有清除自由基活性，分别对其进行清除·OH、 和DPPH·试验，以维生素C为对照，结果见图7。在试验浓度范围内，随着酶解产物质量浓度的升高，其清除自由基的能力逐渐增强。当酶解产物质量浓度为2.0 mg/mL时，其对·OH、 和DPPH·的清除率分别为68.85%、83.62%和82.36%。表明获得的酶解产物具有较强的清除自由基活性。

3 讨论

目前，马氏珠母贝肉活性肽的获取主要通过蛋白酶对贝肉蛋白进行水解得到，时间较长，一般需3～6 h。为了缩短酶解时间，本研究采用聚能式超声波辅助酶解法对马氏珠母贝肉蛋白进行水解，通过单因素及响应面试验优化条件，得到最优酶解条件为：酶解温度48 ℃、加酶量2200 U/g、超声波功率13%、酶解时间12 min，在此条件下的蛋白质水解度为21.937%；虽然略低于尚军等（2009）采用发散式超声波辅助酶解马氏珠母贝肉得到的蛋白质水解度（31%），但酶解时间缩短48 min。可见，聚能式超声波强度更大，短时间内（12 min）即可获得较高的蛋白质水解度。

本研究单因素试验考察酶解温度、加酶量、超声波功率和酶解时间4个因素对马氏珠母贝肉酶解效果的影响，在酶解温度的选择试验中，45 ℃的蛋白质水解度达最高值，与厂家推荐的中性蛋白酶的最适温度（50 ℃）有所偏差，但45 ℃与50 ℃的蛋白质水解度无显著差异，分析原因可能是单因素试验中均加有15%超声波功率，对酶的最适温度有一定影响；在超声波功率的选择试验中，发现在未加超声波的情况下，酶解后马氏珠母贝肉蛋白质水解度显著低于超声波处理的蛋白质水解度，其原因可能是本研究采用聚能式超声波进行强化处理，考虑预处理成本问题，对原料仅进行简单匀浆，处理后原料颗粒度较大，故在未加超声波的条件下，酶首先与溶液中游离的底物及颗粒表面的底物进行反应，很短时间已经反应充分，而颗粒内部的蛋白质很难与酶接触。

酶解得到的活性肽生物活性与水解度间存在较大的关联性。一般在水解度较低的情况下，活性肽清除自由基的能力会随着水解度的提高逐渐增强，但水解度超过一定值后，活性肽清除自由基的能力反而会随着水解度的提高逐渐降低（刘偲琪等，2014），因此在制备抗氧化肽的过程中不应将水解度作为唯一参考指标。本研究的马氏珠母贝肉蛋白质水解度为21.937%，酶解产物在2.0 mg/mL质量浓度下对·OH、 和DPPH·的清除率分别为68.85%、83.62%和82.36%，高于胡雪琼等（2009）的研究结果，且达到或超过一些具有清除自由基活性的天然产物，如玛卡多糖（Zha et al.，2014）、玉米抗氧化肽（Jin et al.，2016）。此外，虽然本研究的蛋白水解度较尚军（2010）的研究结果（33.8%）低，但具有更高的清除自由基活性，该结果与曹文红等（2009）研究发现当蛋白质水解度介于15%～25%时，马氏珠母贝肉酶解产物具有更高清除自由基活性的结论一致。马氏珠母贝肉蛋白质水解度为21.937%时，其清除自由基的活性已达到较高值，该结果可为利用马氏珠母贝肉生产生物活性肽相关产品提供参考依据。本研究仅考察了单一蛋白质水解度下的自由基清除活性，下一步将系统研究二者间的关系，对于生产实践将具有更好的指导意义，并进行酶解产物氨基酸序列分析，对于阐明抗氧化肽构效关系也有一定帮助。

4 结论

优化得到的超声波辅助酶解马氏珠母貝肉工艺参数准确可靠，酶解时间显著缩短，酶解产物具有明显的清除自由基活性，可作为具有抗氧化作用的保健食品、保健酒等产品的优质原料。

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（責任编辑 罗 丽）