基于ISSR标记的福建省钩锥遗传多样性分析

田艳伶　李柏海　李志辉　杨模华　张斌　周鑫伟

摘要： 該研究利用ISSR分子标记，对分布于福建省内5个样地（ 邵武、建阳、建瓯、周宁和屏南）的61个野钩锥（Castanopsis tibetana）单株的遗传多样性进行了分析，并采用聚类分析方法探讨了它们的遗传关系。结果表明： 用10条ISSR引物从61个单株的基因组DNA共扩增出158条带，包含145条多态性条带，多态性条带百分率达91.77%，其中引物 UBC817、UBC819与UBC842的多态性条带百分率（PPB）为100.0%。各居群的多态性条带百分率（PPB）、有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样度（H）和Shannons多样性指数（I）等各遗传指数差异较大，其中各项遗传指标中最高的为邵武居群，而周宁居群则最低。5个居群的基因分化系数和基因流分别为0.144 0和2.973 0，说明5个居群总遗传变异的14.40%存在于居群间，85.60%存在于居群内。种间总基因多样度分别为0.395 8，种内基因多样度分别为0.338 8，表明钩锥种间遗传多样性较高，且种间变异大于种内变异。各居群间的遗传距离差异较大； 其中，邵武与建瓯居群的遗传距离最近，仅为0.081 5； 建阳和周宁居群的遗传距离最远，为0.162 9。通过聚类分析可将5个钩锥居群聚为3支，屏南与周宁的居群各自独立聚为2支；来自邵武、建瓯及建阳的居群聚为一支，且可进一步分为两个亚支，建阳居群为1个亚支，邵武和建瓯居群聚为1个亚支。供试的钩锥具有较高的遗传多样性，存在着较为频繁的基因交流。该研究结果较准确地揭示了钩锥种间的遗传多样性。

关键词： 钩锥， ISSR标记， 遗传多样性， 基因分化， 聚类分析

中图分类号： Q943

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）01004208

Abstract： Castanopsis tibetana is an evergreen hard wood tree of red Castanopsis， which is one of the excellent commercial tree species. C. tibetana has great development prospect and ecological value in China. In this paper， the genetic diversity of 61 individuals of C. tibetana collected from five plots （Shaowu， Jianyang， Jianou， Zhouning and Pingnan） in Fujian Province of China was analyzed by means of intersimple sequence repeat（ISSR） marker， and the genetic relationship among these individuals also was discussed by cluster analysis method. The results showed that 158 bands were amplified from genomic DNA of 61 C. tibetana individuals by ten intersimple sequence repeat （ISSR）primers， and there were 145 polymorphic bands with percentage of polymorphic band of 91.77%， in which， the percentage of polymorphic band of UBC817， UBC819 and UBC42 reached 100.0%. Percentage of polymorphic band（PPB）， effective number of alleles （Ne）， Neis gene diversity （H） and Shannons diversity index （I） were obviously different among five C. tibetana populations，in which all indexes of population in Shaowu were the highest，populations in Zhouning was the lowest. Gene differentiation coefficient and gene flow of five populations was 0.144 0 and 2.973 0，respectively， indicating that 14.40% of overall genetic variation of five populations exists among populations and 85.60% within populations. The gene diversity among species （Ht） and within species （Hs） were 0.395 8 and 0.338 8. It is suggested that the genetic diversity among species of C. tibetana was relatively rich and the interspecies variation degree was higher than intraspecies. Genetic distance among all populations differed obviously， and the genetic distance， between populations of Shaowu and Jianou was the nearest （only 0.081 5） while that between populations of Jianyang and Zhouning was the farthest （0.162 9）. Five populations could be divided into three groups by cluster analysis， in which populations of Pingnan and Zhouning were two separate groups，while three populations of Shaowu，Jianou and Jianyang were gathered into one group， which could be divided into two subgroups further， one was Jianyang population and another contained populations of Shaowu and Jianou. It is suggested that populations of C. tibetana tested possessed higher genetic diversity， and there were frequent gene exchange. The genetic diversity of C. tibetana could be accurately revealed by means of ISSR marker analysis.

Key words： Castanopsis tibetana， ISSR marker， genetic diversity， gene differentiation， cluster analysis

钩锥（Castanopsis tibetana）为壳斗科锥属 （Castanopsis）树种，又名钩栗或钩栲，为常绿阔叶高大乔木，高达30 m；材质坚硬，耐水腐，为优良的建筑、车船、家具和室内装饰用材（张宏达，1988；林敏和黄宗安，2003），属红锥类，为长江以南极具重要开发前景的珍贵用材树种。有关钩锥方面的研究尚不多见，已有的研究主要集中在种群生态及生命表分析（林敏和黄宗安，2003；张嘉生，2005）、种子特性（王佩兰等，2013）与播种育苗（陈养，2007；李纯教，2012）等方面，目前还无任何研究涉及钩锥分子水平这一方面。对钩锥种群生态研究的结果表明，现存的钩锥常散生于常绿阔叶林中，居群规模小、更新情况差，居群处于衰退状态（林敏等，2003；李纯教，2012）。因此，在分子水平上对钩锥居群进行遗传结构及其遗传多样性，可为钩锥珍贵用材林的营建、应用与推广提供必要的理论依据，也能为钩锥种质资源的有效保护提供相关的遗传改良策略。

ISSR分子标记，即简单重复序列区间扩增多态（ intersimple sequence repeat）分子标记。此标记不受环境与季节等外在因素影响，能有效揭示整个基因组的一些特征，用于检测2个SSR之间一段DNA 序列上的多态性（Zietkiewicz & Rafalski，1994）。ISSR具有操作方便、模板用量少、产物多态性丰富和结果重复性高等优点，已被广泛用于林木种质资源遗传结构、品种鉴定与遗传多样性分析（李海生和陈桂珠，2004；赵冰和张启翔，2008；李乃伟等，2011）。目前，ISSR标记技术主要运用于种质资源鉴定（Fang et al，1988）、指纹图谱构建（Cho et al， 2002）、遗传多样性分析（Ge & Sun，1999；）和亲缘关系研究（林乐静等，2015）等方面。本研究通过ISSR分子标记技术，在遗传结构与遗传多样性等方面对5个福建野生居群进行了遗传分化水平比较，采用聚类分析方法对钩锥不同居群进行了遗传关系的研究，为进一步评价钩锥种质资源的遗传多样性提供依据。

1材料与方法

1.1 材料

于2013年7月，在福建邵武、建阳、建瓯、周宁和屏南选取了5个钩锥野生居群61个单株（表 1）。对各居群进行了种质资源调查，采集了具有代表性的待测样品，选取的植株无病虫害且生长状况良好，将采集好的健康嫩叶装于编号的锡箔纸中包好，再放入装有适量硅胶的封口袋中，及时运回实验室，于-70 ℃冰箱保存备用。

所用仪器和试剂： Eppendorf Centrifuge 5415R冷冻离心机，GeneAmp PCR System 9700扩增仪，WH2微型旋蜗混合仪，电热恒温水浴锅，DYY12型稳压稳流电泳仪，BioRad紫外凝胶成像仪。ISSR 引物的设计参考加拿大哥伦比亚大学（UBC）（余艳等，2003），由上海英骏生物技术有限公司合成； Marker由广州东盛生物科技有限公司提供；dNTPs、Taq DNA 聚合酶和 10×PCR buffer 等购自TINGEN公司。

1.2 方法

1.2.1 钩锥DNA提取每个钩锥样品称取3 g，液氮中充分粉碎，采用天根试剂盒法提取钩锥总DNA（田艳伶等，2015），-20 ℃的冰箱储存、备用。

1.2.2 引物的筛选参照锥栗ISSR遗传分析中引物筛选的方法（龚榜初和刘国彬，2013），通过对100条ISSR引物进行筛选，共筛选出10条谱带清晰，信号强且，重复性好且扩增结果稳定的引物，用于本研究钩锥遗传结构分析。

1.2.3 PCR 扩增与检测ISSRPCR反应体系总体积为20 μL，含30 ng模板DNA，0.4 mmol·L1 dNTPs，0.75 U Taq DNA聚合酶，3 mmol·L1 Mg2+， 0.3 μmol·L1引物，用纯水补足。钩锥ISSRPCR反应扩增程序为94 ℃预变性2 min；然后于94 ℃变性30 s、50～59.3 ℃退火30 s（根据不同引物的Tm值而设定具体退火温度）、68 ℃延伸2 min 30 s，共40个循环；72 ℃延伸7 min保存。用质量体积分数为0.7%的琼脂糖凝胶（含少量溴化乙锭）电泳30～35 min（4～5 V·cm1）（田艳伶等，2015），电泳结束后在紫外凝胶成像仪上成像并检测钩锥DNA的提取浓度及其质量。

1.3 数据统计和分析

将清晰、多态性好、迁移率相同的条带按照同源位点进行处理，条带出现，赋值“1”，没出现赋值“0”，通过图形资料转化成1、0二元数据矩阵的数据资料。按照Neis（1979）的方法，通过Popgene 1.32软件，在假定种群处于哈迪-温伯格平衡前提下，计算分析总遗传多样性指数（Ht）、居群间基因分化系数（Gst）、Neis居群内遗传多样性指数（Hs）、Neis标准遗传距离（GD）、遗传一致度（GI）、居群间基因流（Nm*）；采用NTSYSpc version 2.10软件计算5个居群61个钩锥样品的遗传相似性系数（SC）和和遗传距离（DS），聚类分析采用UPGMA 法对遗传关系进行研究分析。

2结果與分析

2.1 ISSRPCR 扩增结果分析

利用优化的反应体系从100条ISSR 引物中筛选出多态性高、重复性好的10条引物进行ISSR分析，10条引物的序列以及扩增结果见表2。从表2可见，10 条引物中（AC）n、（AG）n、（GA）n引物占多数，说明钩锥基因中可能存在大量的（AG） 二核苷酸重复序列。不同引物组合扩增出不同的多态性条带数，本研究的10条引物片段长度为250～2 000 bp，共扩增出了158条清晰条带，其中多态性条带145条；参试引物扩增条带数为13～19条，平均每条引物检测到的条带数为15.8。其中检测出的条带数最多的为引物UBC808，达19条；而数量最少的为UBC846号引物，仅13条。其中，多态性条带数最多的为UBC880号引物（18条）；而多态性条带数最少的为UBC830号引物（11条）。各引物的多态性条带百分率（PPB）为73.30%～100.00%，平均为91.77%； 其中 UBC817、 UBC819和 UBC842号引物扩增的PPB均达到 100. 00%。由此可见，供试的5个钩锥居群具有较丰富的遗传变异和遗传多样性。

2.2 钩锥居群遗传多样性分析

表3中记录了采用ISSR分子标记对福建5个钩锥居群进行的遗传多样性指标分析，结果表明：参试各居群的多态性条带数、多态性条带百分率（PPB）、有效等位基因数（Ne）、Shannons 多样性指数（I）和Neis 基因多样度（H）均有明显差异。邵武居群的各项指标均最高，明显高于其他 4 个居群；而周宁居群的各项遗传指标则最低。5 个钩锥居群的多态性条带百分率为84.81% ～ 91.14%，平均值为88.61%； 观测等位基因数（Na）为1.848 1～1.911 4，平均值为1.886 1； 有效等位基因数（Ne）为1.551 7～1.630 7，平均值为1.588 7； Neis 基因多样度（H）为0.323 1～0.362 2，平均值为0.337 8； Shannons信息指数（I） 为0.480 6～0.531 3，平均值为0.499 8。多态性条带百分率最高的为邵武（91.14%），建阳和建瓯次之（90.51%），而屏南（86.08%）和周宁（84.81%）则最低； Ne、H和I等遗传指数最高的均是邵武，建阳和建瓯次之，屏南略低，而周宁则最低。这表明钩锥居群间的遗传多样性水平较高。

本研究进一步利用AMOVA软件 （Excofier， 1992）对分布于福建的钩锥居群内和居群间的分子变异进行了分析。从表4结果可以看出，钩锥居群间变异占13.81%，居群内变异占86.19%，居群内和居群间的变异均极显著（P<0.001）。

从两种方法得出的数据可知， Neis遗传多样性分析的结果和AMOVA分析所得结果相差不大。

2.3 不同种源间的遗传距离及聚类分析

根据ISSR扩增结果组成二元数据矩阵，用SM方法计算5个钩锥居群的遗传相似系数（表4）。表4结果表明，邵武和建瓯居群的遗传距离最近，仅为0.081 5，表明亲缘关系很近。建阳与周宁居群的遗传距离最远，为0.162 9，表明亲缘关系很远，可能与其分布地距离相对较远、生长环境差异较大有关。5个钩锥居群的遗传距离平均值为0.126 6。

依据遗传距离，进行UPGMA聚类分析，获得基于ISSR的5个不同钩锥居群间的聚类图（图1）。从表4和图1可以看出，当λ=0.89时，可将5个钩锥居群聚为两支，邵武、建瓯、建阳和屏南居群聚为一支；周宁的居群单独聚为一支。当λ=0.90时，5个钩锥居群聚为3支，屏南与周宁的居群各自聚为一支；来自邵武、建瓯及建阳的居群聚为一支，细分为建阳居群亚支和邵武和建瓯居群亚支。

通过软件NTsysPc2.10，对来自不同居群的61个钩锥个体进行了UPGMA聚类分析，从图2的遗传关系聚类图我们可以得出，在遗传关系上和遗传结构相一致。从图2可以看出，当相似系数为0.545时，61个钩锥个体可分为三大类，第一类为采自邵武、建瓯和建阳的38个单株；采自屏南的10个单株聚为第二类；而采自周宁的13个单株则聚为第三类。从整体来看，各地区资源有规律的聚类在一起，能按地区单独聚类。

2.4 基因分化

通过POPGENE 软件对 5 个钩锥居群进行遗传分化分析，得出的在种水平上的基因多样度为0.013 5，在居群水平上钩锥的基因多样度为0.016 7，基因流为2.973 0；基因分化系数（Gst） 为0.144 0，即 5 个居群总的遗传变异主要发生在居群内（ 85.60%） ，总变异的14.40% 来自居群间。

3讨论

本研究中，用10个寡聚核苷酸随机引物扩增了5个钩锥居群的基因组DNA，获得了158条清晰稳定的DNA谱带，多态性谱带145条，多态性条带百分率（PPB）达到91.77%，根据谱带的差异较好地区分了5个参试钩锥居群。Hamrick et al（1992）研究发现多数多年生木本树种平均多态位点百分数为 65%。由此可知，供试的钩锥有丰富的遗传多态性。利用ISSR分子标记技术能快速准确地检测其遗传变异，也为钩锥提供了分子标记辅助选择与评价的技术方法。5个钩锥居群61份样品的基因组DNA多态性程度、平均Shannon信息指数及平均Neis基因多样性指数均较高，表明钩锥对其生存环境有很强的适应能力。

聚类分析表明地理分布距离近的钩锥居群聚类在一起，说明这些居群间的遗传背景差异较小。来自邵武、建瓯和建阳居群聚为一类，且邵武与建阳居群间的遗传距离大于和建瓯之间的遗传距离，表明在亲缘关系上来看，邵武和建瓯居群之间的较近；而来自屏南和周宁的居群则各自独立分为两支，说明两者的遗传差异很相对较大。同种居群间的遗传距离一般为 0.03～0.20，相似系数一般为 0.80～0.975的福建钩锥居群间存在着一定的遗传分化，是因为其受环境差异和地理隔离等因素的影响，然而，根据Thorpe（1982）的标准理论值来看，这5個钩锥居群仍然属于同一地理群体。

从反映物种遗传多样性的多个参数上，包括物种水平的Neis基因多样度（0.337 8）、Shannons多样性指数 （0.499 8） 和多态性条带百分率（91.77%）等，均揭示了福建钩锥种内具有较为丰富遗传多样性，且其Neis 基因多样度前人所较研究过的一般针阔叶树种的估算值（0.206）还要高

（Thorpe，1982；Hamrick et al， 1992；张青林和罗正荣，2004）。

基因流（Nm），是影响居群内部和居群间遗传变异程度的重要因素。在群体遗传学理论中， Hamrick et al（1992）和Wright（1931）的研究表明，不管居群大小，当基因流大于或等于1时，就能防止居群间因遗传漂变而引起的遗传分化；若基因流Nm<1，遗传漂变就成为刻划种群遗传结构的主导因素。本研究通过POPGENE 软件得出钩锥基因流为2.973 0，大于1，故能防止钩锥居群间因遗传漂变而引起的遗传分化

由于本研究的实验材料采样范围相对集中，取自福建省内的5个山区，并不能完全地揭示出钩锥的全部遗传背景，故仍需做好扩大钩锥种质资源的收集的工作，最好对已发现的具有代表性的省（区）（如浙江、广西、湖南等）进行样品采集，并采用多种方法对钩锥进行遗传多样性和遗传结构的研究分析，为我们科学地经营、管理、保护和利用钩锥野生种质基因资源，维持其丰富的遗传育种潜力和遗传多样性奠定基础。

参考文献：

CHNE Y， 2007. Artificial breading technology of Castanopsis tibetana [J]. China For Sci Technol， 3：89-90. [陈养， 2007. 钩栗人工育苗技术研究 [J].林业科技开发，3：89-90.]

CHO S， KUMAR J， SHULTZ JL，et al，2002. Mapping genes for double podding and other morphological traits in Chickpea [J]. Euphytica， 128（2）： 285-292.

EXCOFFIER L， SMOUSE PE， QUATTRO JM，1992. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes： application to human mitochondria DNA restriction sites [J]. Genetics， 131： 479-491.

FANG DQ， KRUEGER RR， ROOSE ML，1998. Phylogenetie relationship among selected Citrus germplasm accessions reveals by intersimple sequence repeat （ISSR） markers [J]. Am Soc Hort Sci， 123（4）： 612-617.

GONG BC， LIU GB，2013. ISSR analysis of genetic diversity in natural populations of Castanea henryi [J]. J Plant Genet Resour， 4：581-587. [龔榜初，刘国彬，2013.锥栗自然居群遗传多样性的ISSR分析 [J].植物遗传资源学报，4：581-587.]

GE XJ， SUN M，1999. Reproductive biology and genetic diversity of a crypto viviparous mangrove Aegiceras corniculatum （Myrsinaceae） us in gallozyme and intersimple sequence repeat （ISSR） analysis [J]. Mol Ecol， 8： 2061-2069.

HAMRICK JL， GODT MJW， SHERMANBROYLES SL，1992. Factors influencing levels of genetic diversity in woody plant species [J]. New For， 6： 95-124.

LI CJ，2012. Charateristis and sowing seeding raising technology of Castanopsis tibetana in the south of Fujian [J]. Mod Agric Sci Technol， 13： 185-187. [李纯教， 2012. 皖南山区钩栲特征特性及播种育苗技术 [J]. 现代农业科技， 13：185-187.]

LI HS，CHEN GZ，2004. Genetic diversity of mangrove plant Sonneratia caseolarisin Hainan Island based on ISSR analysis [J]. Acta Ecol Sin， 24（8）： 1657-1663. [李海生，陈桂珠，2004.海南岛红树植物海桑遗传多样性的ISSR分析 [J].生态学报， 8：1657-1663.]

LIN LJ，LI L，ZHU ZY，2015. ISSR analysis of the genetic relationships among 25 Acer plants germplasm resources [J]. Guihaia， 1： 9-14. [林乐静，林立，祝志勇，2015. 25份槭属优良种质资源亲缘关系的ISSR分析 [J].广西植物， 1：9-14.]

LIN M， HUNG ZA，2003. Analysis of Castanopsis tibetana population life table [J]. J Fujian For Sci Technol， 2： 9-13. [林敏，黄宗安，2003. 钩栗种群生命表分析 [J].福建林业科技， 2：9-13.]

LI NW，HE SA，SHU XC，et al，2011. Genetic diversity and structure analyses of wild and exsitu conservation populations of Taxus chinensis var. mairei based on ISSR marker [J]. J Plant Resour Environ， 1： 25-30. [李乃伟，贺善安，束晓春， 等，2011. 基于ISSR标记的南方红豆杉野生种群和迁地保护种群的遗传多样性和遗传结构分析 [J].植物资源与环境学报， 1：25-30.]