H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及其表位鉴定

刘晓婧 凌红丽 蒋贻海 张园园 赵明 杨光烈 于春梅 薄宗义

摘要[目的]制备H9N2亚型禽流感病毒单克隆抗体和鉴定表位。[方法]选取H9N2亚型禽流感病毒（AIV）WD-1株的纯化抗原免疫BALB/c小鼠，对获得2株抗H9N2亚型禽流感病毒的特异性单抗4C10和6E3表位进行鉴定。[结果]单抗4C10和6E3分别属于IgG1和IgG2b亚型，ELISA检测效价分别为1∶103和1∶105；HI效价分别为215和214；2株单抗均具有雞胚中和活性。利用噬菌体展示表位技术对2株单抗的抗原表位进行鉴定，结果显示均为针对HA 蛋白的1个线性表位。[结论]该研究为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供了依据。

关键词禽流感病毒；H9N2亚型；单抗；抗原表位

中图分类号S852.4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）10-0129-03

Preparation of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus Antibodies and Epitope Identification

LIU Xiaojing， LING Hongli*， JIANG Yihai et al

（Qingdao Vland Biological Products Co. Ltd，Qingdao，Shandong 266114）

Abstract[Objective] To prepare H9N2 subtype avian influenza virus antibodies and identify epitope.[Method] The epitopes of two monoclonal antibodies （McAbs） specific to H9 subtype avian influenza virus （AIV） were identified by cell fusion with the BALB/c mice immunized with purified H9N2 AIV WD1. [Result]The 4C10 and 6E3 were belonged to IgG 1 and IgG 2b，repectively. The ELISA titers were 1∶103 and 1∶105. The HI titers in their ascites were 215 and 214. Two monoclonal antibodies had chicken embryo neutralizing activity. The antigen epitopes of two monoclonal antibodies were all linera epitopes targeting HA protein. [Conclusion] The study laid the foundation for the establishment of rapid diagnostic method of avian influenza virus.

Key wordsAvian influenza virus；H9N2 subtype；Monoclonal antibody；Antigen epitopes

禽流感（Avian Influenza，AI）是由A型流感病毒引起的一种禽类传染病，感染动物表现出从呼吸系统到全身败血症等多种症状[1-2]。流行病学调查发现，目前对养殖业危害比较大的是H5和H9亚型禽流感。H9亚型禽流感病毒本身引起的死亡率较低，但能与其他病原混合感染易感动物，引起较高的死亡率，此外也有H9亚型禽流感病毒感染人的报道[3]。目前主要采取疫苗免疫和严格的生物安全措施来控制该病。鉴于H9亚型禽流感病毒对养禽业的危害及其在公共卫生学上的意义，加强对此亚型病毒的检测和疫病防控迫在眉睫[4]。该研究选取了 H9N2亚型禽流感病毒WD-1株，制备了针对HA蛋白且具有中和活性的特异性单克隆抗体（McAbs）。利用噬菌体展示表位技术对其抗原保护决定簇进行鉴定[5]，以期获得具有免疫保护功能的抗原表位。该研究旨在通过体外筛选、人工制备等方法，获得禽流感病毒特异性McAbs，以期为禽流感病毒快速诊断方法的建立提供依据。

1材料与方法

1.1主要试验材料

H9N2 亚型禽流感病毒株WD-1由青岛蔚蓝生物制品有限公司提供；H5、H7、H9亚型标准血凝抗原及血清均从哈尔滨兽医研究所获得；对照病毒株NDV 毒株Lasota 由青岛蔚蓝生物制品有限公司提供；IBV 毒株Massachussetts41和SP2/0细胞由青岛蔚蓝生物制品有限公司生药研发实验室保存；表达AIV（H9N2）的HA重组质粒Pet28a-HA 由青岛蔚蓝生物制品有限公司生药研发实验室构建；SPF鸡胚购自梅里亚；6～8周龄SPF BALB/c 雌性小鼠购自北京医学院实验动物中心。

1.2主要试剂

PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、限制性内切酶、DNA Marker均购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自NEB公司；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒购自Axygen公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠IgG（IgG-HRP）抗体和兔抗鼠IgG-FITC均购自Sigma公司；Ni-NTA Agarose和Chromatography Column纯化柱均购自Qiagen公司；Prestained Protein Ladder 购自MBI公司；PEG6000购自Merc公司；蔗糖购自上海国药；噬菌体展示肽库试剂盒购自NEB公司。

1.3H9亚型禽流感病毒的纯化

将保存的禽流感病毒用生理盐水按1∶10 000倍稀释后接种于10日龄鸡胚，每个鸡胚注射0.2 mL，37 ℃、60%湿度培养3 d后将鸡胚置于4 ℃过夜，收集尿囊液测定其血凝活性。反复冻融3次后离心取上清，缓慢搅拌加入NaCl至 0.5 mol/L，再搅拌加入等体积10%的PEG6000，4 ℃过夜。8 000 r/min离心30 min取沉淀，加入原体积10%的PBS混悬后4 ℃过夜。8 000 r/min离心取上清，用20%、40%、60%的蔗糖18 000 r/min密度梯度离心2 h，收集病毒层，加入适量PBS后18 000 r/min离心2 h取沉淀PBS混悬，测定血凝价和蛋白浓度，分装后于-20 ℃保存备用。同时SPF鸡胚尿囊液同上操作留存阴性对照品。

1.4动物免疫

将H9N2 禽流感病毒经蔗糖密度梯度离心纯化后，按每只100 μg（ 0.2 m L）分点皮下注射BALB/c小鼠。初次免疫后14 d，再皮下分点加强免疫1次。融合前3 d，采用尾静脉注射法加强免疫1次。

1.5杂交瘤细胞的制备

参照文献[6]，将小鼠脾细胞和SP2/0 融合后的细胞用禽流感病毒蛋白间接ELISA和HA间接ELISA平行检测，取双阳性的克隆，用有限稀释法进行克隆培养。克隆3次后获得稳定分泌特异性McAbs。将取得的阳性细胞株上清用HI试验做筛选，取有HI效价的克隆进行建株。

1.6HA1重组蛋白间接ELISA 方法的建立

按常规间接ELISA 操作，利用方阵法确定McAbs 的筛选条件。将该试验制备的重组HA1蛋白纯化后浓度为1.25 mg/mL，用包被液对其进行1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500 倍稀释，用PBS对阳性血清进行1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000倍稀释。以阳性孔OD值最接近于1，P/N 值大于2.1的蛋白和血清浓度作为最佳工作浓度。

1.7阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆纯化

用间接ELISA检测方法及间接免疫荧光法（Immunofluorence assay，IFA）检测杂交瘤细胞培养上清，筛选出的阳性杂交瘤细胞，及时进行克隆纯化及扩大培养，克隆纯化采用有限稀释法进行。剩余细胞扩大培养后进行细胞冻存。

1.8McAbs的特性鉴定

1.8.1

Western blot分析。按常规SDS-PAGE方法：6%浓缩胶，15%分离胶进行电泳后，PVDF膜，15 V转印30 min，将转印后的PVDF膜封闭过夜后，PBST洗涤后将腹水1∶200稀释后37 ℃孵育1 h，洗涤后加二抗37 ℃孵育1 h，洗涤后DAB避光显色15～30 min至条带清晰，用蒸馏水终止显色反应。

1.8.2

免疫球蛋白亚类鉴定。应用SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒（Southern Biotech公司）鉴定AIV H9单克隆抗体的亚类。具体操作：取AIV纯化病毒作为抗原包被的间接ELISA板，以杂交瘤细胞培养上清作为一抗；以1∶250倍稀释HRP标记的羊抗鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、κ、λ作为二抗；室温下TMB避光显色15 min，读取OD450值。

1.8.3

特异性检测。对筛选判为阳性的细胞培养上清，采用间接ELISA方法和血凝抑制试验，分别与H5 亚型、H7亚型和H9亚型AIV 血凝素分型抗原、EDS-76病毒、NDV、IBV 抗原进行特异性交叉检测。

1.9McAbs腹水的制备与纯化

取10～12周龄的BALB/c雌鼠，每只腹腔注射0.5 mL灭菌液体石蜡，7 d后腹部注射5×105个阳性杂交瘤细胞，7～10 d后观察小鼠腹部膨大明显时，立即采集腹水。8 000 r/min，离心5 min，以去除油脂，收集上清，分装后于-20 ℃冻存。

将腹水按照HiTrap Protein G HP说明书，使用Protein G柱进行纯化。纯化后的腹水用SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定。

1.10McAbs腹水的抗体效价

获得的AIV H9单抗腹水自1∶100开始进行10倍连续稀释至1∶108，用建立的间接ELISA方法测抗体效价，同时设立阴、阳性对照。P/N比值大于2.1的McAbs的最大稀释度为其效价。

1.11鸡胚中和试验

1.11.1

鸡胚半数致死量（LD50）的测定。取9日龄鸡胚分为11组，每组5只鸡胚，其中1组作为对照组。将AIV H9胚毒按10-1～10-10做倍比稀释。分别将倍比稀释的病毒液经尿囊腔接种到鸡胚中，每只注射0.2 mL，对照组注射等量的生理盐水。逐日观察每组鸡胚的死亡数，并记录。按Reed和Muench氏法计算鸡胚半数致死量LD50。

1.11.2

鸡胚中和试验。通过对鸡胚半数致死量的测定，选择病毒液的稀释度，用灭菌生理盐水将病毒稀释成每0.1 mL含有100个LD50。将杂交瘤细胞株培养上清按10-1～10-6做倍比稀释。将病毒液分别与稀释单抗细胞培养上清等量混合，于37 ℃感作1 h。试验组为6组，其中不同稀释度的单抗分别为1组，另设正常对照组和病毒对照组（100个LD50），共8组。对试验组每个稀释度接种5只鸡胚，每只02 mL，正常对照组注射02 mL生理盐水，病毒对照组接种0.2 mL含有100个LD50的病毒液，置于37 ℃孵化箱孵育144 h，弃去24 h内死亡的鸡胚，此后每6 h照蛋1次，及时将死亡胚取出，至144 h将鸡胚全部取出，并放置4 ℃保存。逐日观察每组鸡胚的死亡数，并记录。按Reed和Muench氏法计算中和指数。

1.12McAbs抗原表位的鉴定

按照NEB 公司的噬菌体展示肽说明书对McAbs对应的抗原表位进行鉴定。测定扩增前后噬菌体的滴度，经过3轮淘筛，第3轮淘选产物测完滴度后随机挑取噬菌体克隆进行扩增。在扩增噬菌斑进行DNA测序时，利用ELISA方法检测所选多肽对靶分子的结合能力。

将100 μL的纯化单抗以 100 μg/mL 的浓度包被 96 孔板，每个待鉴定克隆包被1排，在密封的湿盒中4 ℃包被过夜。甩出多余靶分子溶液，在纸巾上拍除残液。每孔加满封阻液，4 ℃封闭1 h。另外，还需单独准备一个微量滴定板进行噬菌体的系列稀释，也要用封阻液封阻。甩出封阻液，TBST洗板6次，甩去洗液。在单独的封阻板中每孔預先加入200 μL TBST，每排第1孔加1×1012个病毒子，开始对噬菌体进行4倍系列稀释至第12孔，2×105个病毒子。将稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中，室温振荡作用1 h。TBST 洗板 6 次，甩出洗液。二抗每孔加入 M13-HRP抗体（1∶5 000倍稀释）200 μL，室温振荡作用1 h。TBST 洗板 6 次，甩出洗液。加入OPD显色液100 μL/孔，显色 10 min，终止液终止，酶标仪读值OD492。按各个噬菌体OD值（S）与阴性对照OD值（N）的比值（S/N）>2.1鉴定阳性克隆株。

2结果与分析

2.1H9亚型禽流感病毒的纯化与鉴定

收获的接毒尿囊液经蔗糖梯度差速离心后，可明显分为4个条带。分别取出4个条带，测定其血凝滴度，确定病毒抗原主要所在位置。结果表明，40%处的蛋白带血凝价为1∶214；60%处蛋白带血凝价为1∶ 216，将其同时收集作为免疫抗原。

2.2杂交瘤细胞株的筛选及特性分析

经过3次亚克隆纯化，最终获得3株能分泌McAbs的杂交瘤细胞株：4C10、5D8和6E3。

2.2.1

Western blot分析结果。采用H9N2亚型禽流感病毒WD-1株重组HA1蛋白，对3株单抗4C10、5D8和6E3进行Western blot鉴定。其中单抗4C10和6E3均在约51 kD处有明显条带，证明为HA1蛋白的单抗，5D8未见条带，可能为针对HA1蛋白的构象抗体。

2.2.2

单克隆抗体的免疫球蛋白亚类鉴定。采用美国

Southern Biotech公司的SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒对所获得的3株针对AIV H9的单抗进行免疫球蛋白亚类鉴定，鉴定结果显示，单抗4C10和5DB均属于IgG1/；单抗6E3属于IgG2b/。

2.3单克隆抗体的抗体效价（ELISA和HI效价）

对3株单抗制备的腹水效价进行测定，结果如表1所示。ELISA检测效价单抗6E3的效价最高（1∶105）；HI检测效价单抗4C10和6E3的腹水效价较高，分别为215和214。

2.6McAbs抗原表位鉴定

利用噬菌体12肽库淘选针对H9亚型AIV 单抗4C10和6E3的克隆，3轮淘洗后，能与单克隆抗体4C10和6E3特异性结合的噬菌体得到了选择性富集，随机挑取20个克隆，经ELISA阳性鉴定后获得10个阳性克隆（P/N≥2.1）。

阳性克隆经上海生工生物工程有限公司测序，对测序结果进行对比分析，2株单抗对比显示其一致序列为CSKYIGIKS，与所用毒株的HA 蛋白编码氨基酸序列比对发现其与aa257～aa265有7 个氨基酸位点完全匹配，提示257CRKYIGVKS265为HA 抗原的1个线性表位。

3讨论

近年来H9亚型禽流感病毒的变异加剧，对养殖业的发展和社会公共安全的威胁也越来越大。病毒分离鉴定和HI试验等方法是目前诊断禽流感病毒的常用手段，但多用于实验室的检测，而临床上期待针对禽流感病毒的快速诊断试剂，如免疫胶体金试纸条、禽流感多重检测基因芯片等产品。

该研究应用杂交瘤技术，通过体外筛选、人工制备等方法研制出了针对H9亚型禽流感病毒HA1蛋白的特異性单克隆抗体，并鉴定出一段具有免疫保护功能的抗原结合表位，旨在通过对功能性抗原表位的进一步研究，针对性地开发出一系列有应用价值的快速诊断和治疗用禽流感功能型抗体。通过对抗体的表达及亲和力改进，实现抗体的大规模制备，推动禽流感病毒抗体产业化进程。