球孢白僵菌侵染对家蚕抗氧化水平的影响

王树昌 赫荣帆 陆敏泉 黄华平 王娜玉 郭锡杰 耿涛

摘 要 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）是一種广谱性、强致病性的病原真菌，然而其致病机制尚不明确，进一步阐释球孢白僵菌尤其是球孢白僵菌毒素的致病机制，对生防应用和病害防控具有重要意义。本研究检测了家蚕幼虫自然感染球孢白僵菌和注射球孢白僵菌毒素以及家蚕细胞添加毒素后，幼虫存活率、家蚕组织和细胞的总抗氧化活力、SOD和CAT酶活性及相关基因表达水平的变化。结果表明，家蚕2龄幼虫感染白僵菌后期（33～48 h），5龄幼虫感染球孢白僵菌后期（48～72 h），5龄幼虫和BmN细胞注射（添加）球孢白僵菌毒素24 h后，家蚕血淋巴、脂肪体、中肠和马氏管组织、BmN细胞总抗氧化活力、SOD和CAT酶活性显著降低；脂肪体、中肠、马氏管组织和BmN细胞中Bmsod和Bmcat基因表达水平在感染后期和添毒后显著下调表达；球孢白僵菌毒素能够诱导家蚕BmN细胞发生凝集反应并最终凋亡崩解；家蚕幼虫添加外源SOD和CAT等抗氧化剂后，能显著提高家蚕的存活时间。以上结果说明，球孢白僵菌侵染家蚕后，可能通过分泌毒素攻击脂肪体、中肠和马氏管细胞，下调Bmsod和Bmcat基因的表达，降低机体的总抗氧化能力，破坏家蚕的氧化还原平衡，损伤组织器官功能并最终导致家蚕死亡；同时破坏家蚕免疫系统，获得免疫逃逸，以利于菌丝生长、繁殖。

关键词 球孢白僵菌；家蚕；真菌毒素；SOD；CAT

中图分类号 S884 文献标识码 A

Abstract Beauveria bassiana， a broad-spectrum entomopathogenic fungi with the strong pathogenicity. However， the pathogenic mechanism of B. bassiana was still need to be specifyied the pathogenic mechanism of B. bassiana especially the Beauveria toxins have the important significance for the study on bio-control and disease resistance. In this paper， the total antioxidant activity， SOD（Superoxide dismutase）activity， CAT（Catalase）activity and expression levels of Bmsod and Bmcat genes in hemolymph， midgut， fat body and malpighian tubule of silkworm larvae infected with B. bassiana and injected with Beauveria toxins were examined. In addition， the effects of SOD， CAT and Beauveria toxins on the survival rates of silkworm larvae infected with B. bassiana were also examined. Further more， cellular injury of BmN caused by Beauveria toxins were detected. The results showed that total antioxidant activity， SOD activity， CAT activity and expression levels of antioxidant genes（Bmsod and Bmcat）in 2 instar silkworm larvae（especially from 33 hours to 48 hours post infection with B. bassiana）， in midgut， fat body and malpighian tubule of 5 instar silkworm larvae（especially from 48 hours to 72 hours post infection with B. bassiana and 48 hours after injected with Beauveria toxins）， and in BmN cells（24 hours after injected with Beauveria toxins） reduced. In addition， Beauveria toxins could induce the agglutination of BmN cells and finally encourage apoptosis and disintegration. Furthermore， the exogenous antioxidants（SOD and CAT）could relieve the damage caused by Beauveria toxins. The results above indicated that B. bassiana might secrete toxins， which would attack the fat body， midgut and malpighian tubules of silkworm and down-regulate the expression levels of Bmsod and Bmcat genes， decreased the total antioxidant capacity and disrupt the balance of antioxidant system， which causing function injury of silkworm tissue or organ and lead to the death eventually. Besides， Beauveria toxins might destructed the immune system of silkworm in order to obtain immune escape， which was conducive to mycelial growth and reproduction.

Key words Beauveria bassiana； Bombyx mori； Beauveria toxins； superoxide dismutase； catalase

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.023

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）具有寄主范围广、致病性强、易于培养等优势，是研究最早和应用最广的生防菌种之一[1-2]。同时，球孢白僵菌可以感染家蚕（Bombyx mori）、蜜蜂等经济昆虫，导致僵病发生而给相关产业造成重大损失[3-4]。然而球孢白僵菌侵入宿主导致宿主死亡的机制尚不清楚，不仅影响了球孢白僵菌作为生防制剂的生态效益，也限制了经济昆虫防病措施的研究。

昆虫病原真菌菌丝突破体壁或消化管道等屏障进入宿主体内后，产生芽生孢子，进而发育成芽生菌丝，而后菌丝大量快速增殖，竞争性消耗宿主的营养成分，并在感染宿主的中后期入侵并破坏宿主的组织、器官，使组织细胞发生病变、萎缩、凋亡，引起组织损伤和功能紊乱，最终导致宿主营养枯竭而死亡[2，5]。而近年来一些研究表明，白僵菌毒素可能是导致昆虫死亡的主要原因[6-7]。已发现和鉴定的球孢白僵菌毒素有白僵素（beauverin，环状三羧酸肽）、卵孢霉素（2，2'，5，5'-tetrahydroxy-4，4'-ditoluquinone）、白僵菌交酯（beauve rolide）和球孢交酯（bassianolide）等[8]。真菌毒素能够攻击宿主昆虫的脂肪体、马氏管、肠等组织，妨碍正常生理功能，抑制宿主免疫反应，直至宿主死亡[9]。但白僵菌毒素对宿主昆虫的作用机制尚不清楚。

家蚕是人类长期驯化和饲育的重要经济昆虫之一，为鳞翅目昆虫的模式生物，饲育方便，生理、遗传背景的研究比较深入，是研究宿主-病原互作机制的理想材料[10-11]。本实验以家蚕和球孢白僵菌为实验材料，分别检测了家蚕2龄和5齡幼虫组织感染球孢白僵菌后抗氧化水平和相关基因表达水平的变化；还检测了注射毒素和外源抗氧化剂，对家蚕5龄幼虫存活率、抗氧化活力和相关基因表达水平的影响，以及毒素对家蚕BmN细胞的损伤作用。通过以上实验来说明球孢白僵菌毒素对家蚕氧化还原平衡的影响，进一步明确球孢白僵菌对宿主昆虫的致病机制。

1 材料与方法

1.1 材料

家蚕p50（大造）品系由中国农业科学院蚕业研究所家蚕种质资源库提供；球孢白僵菌HN6菌株由中国农业科学院蚕业研究所家蚕生理病理研究室从自然发病的蚕体上分离、鉴定和保存。

PCR试剂盒、RNApure ultrapure total RNA extraction kit（RN0302）、qRT-PCR kit、BCA蛋白含量检测试剂盒购自博凌科为生物科技有限公司。Total Antioxidant Capacity Assay（FRAP method）、Total SOD activity assay kit（WST-8 method）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）购自碧云天生物技术有限公司。Total CAT activity assay kit（UV method）购自南京建成生物工程研究所。PrimeScript RT PCR kit购自宝生物公司。

1.2 方法

1.2.1 球孢白僵菌侵染家蚕 家蚕p50幼虫饲育至2龄和5龄起蚕，浸没于球孢白僵菌孢子悬液（1×108个/mL） 10 s接种，以浸没无菌水为对照组。200头2龄蚕幼虫为1组，做2个生物学重复，温度（25±1） ℃和95%湿度条件下取新鲜桑叶饲育幼虫。每3 h，取5头家蚕为1个样本，液氮速冻，-80 ℃保存。100头5龄蚕为1组，每组做2个生物学重复，每隔6 h，选取实验组和对照组家蚕各5条，解剖家蚕，分别采集各组织样本，液氮速冻后于 -80 ℃保存。

1.2.2 提取球孢白僵菌毒素和注射家蚕幼虫以及添毒BmN细胞 1 L SMAY发酵液，滤纸抽滤和离心后，上清液即为毒素代谢物粗提液。采用活性炭吸附法提取球孢白僵菌毒素[12-13]。将毒素粗提物溶解于1 mL 0.04 mol/L pH6.6磷酸缓冲液。

取5龄第2天幼虫，用微量注射器吸取上述毒素溶液，按照5 μL/头 注射家蚕幼虫，以注射0.04 mol/L pH6.6磷酸缓冲液为对照组。选取实验组和对照组家蚕各5条，解剖家蚕，分别采集各组织样本，液氮速冻后于-80 ℃保存。

选择细胞长势良好的家蚕BmN细胞，传代培养于6孔板中；24 h后，细胞贴壁率达到70%左右，每日向培养室内加入20 μL（体积比1%）球孢白僵菌毒素，轻轻混匀；添加毒素后，倒置显微镜下观察细胞形态和内部变化并拍照记录。添毒24 h后，收集细胞，-80 ℃保存。

1.2.3 总抗氧化活力、SOD和CAT酶活力的检测

取家蚕2龄幼虫、5龄幼虫组织和BmN细胞样本，分别加入1 mL预冷的0.1 mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液，冰浴中研磨匀浆，4 ℃，1 000 r/min离心10 min，转移上清液至干净无菌的EP管中即为粗酶液。分别按BCA蛋白含量检测试剂盒、Total Antioxidant Capacity Assay（FRAP method）、Total SOD activity assay kit（WST-8 method）和Total CAT activity assay kit（UV method）说明书检测各处理组样品中蛋白含量和抗氧化活力。蚕体和组织样品酶活力用U/mg蛋白表示，血液样品酶活力用U/mL表示。

1.2.4 球孢白僵菌毒素对家蚕幼虫存活率的影响

从冰箱取出SOD和CAT，用0.5 mL 0.15 mol/L NaCl溶液溶解，分别制备6 000 U/mL的SOD溶液和0.1 g/mL的CAT溶液，作为外源抗氧化剂。取5龄第2天幼虫，每头幼虫注射1 μL孢子悬液（1×108个/mL）以接种球孢白僵菌，培养6 h后，分别注射3 μL毒素、3 mL SOD溶液、3 μL CAT溶液、3 μL毒素+SOD溶液、3 μL毒素+CAT溶液。取新鲜桑叶在标准条件下饲育幼虫，每小时记录幼虫的死亡数，计算存活率，绘制存活率曲线。

1.2.5 RNA提取和cDNA合成 总RNA的提取以及基因组DNA的去除按照超纯总RNA提取试剂盒DNA消解说明书进行。2 μg总RNA加入到20 μL反转录反应体系，按照PrimeScript RT PCR kit说明书合成cDNA，于-20 °C保存。

1.2.6 实时定量PCR 根据NCBI登录的Bmsod基因、Bmcat基因和家蚕管家基因Bmactin 3的cDNA序列，用Primer 6.0软件设计qRT-PCR引物，序列见表1，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行引物合成。

按照qRT-PCR Kit说明书配制反应体系：2 × SYBR Premix 10 μL，F引物0.4 μL，R引物0.4 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O补足至20 μL。每个反应设3个重复。三步PCR反应程序为：95 ℃，5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 34 s，40个循环。用2-△△CT method[14]计算不同样本中Bmsod和Bmcat的表达模式。

1.3 数据分析

用SSPS 19.0分析软件中χ2检验检测处理组间的差异显著性（p<0.05为差异显著，标注“*”，p<0.01为差异极显著，标注“**”）；应用Probit回归计算各处理组的LT50及95%置信区间。

2 结果与分析

2.1 家蚕2龄幼虫感染球孢白僵菌后抗氧化水平的变化

总抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力是抗氧化水平的重要检测指标。2龄蚕酶活检测结果表明，家蚕感染球孢白僵菌后总抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力在感染过程中略有升高，而在感染后期则显著下降，分别下降81.6%、83.3%和85.5%（图1）。实验结果说明2龄家蚕感染球孢白僵菌后期机体的抗氧化平衡遭到破坏。

定量实验结果表明，Bmsod基因在球孢白僵菌侵染家蚕早期（12～18 h），表达水平开始下调，最高下調约7倍，而后恢复正常水平；但是在侵染后期（约33 h-家蚕死亡）则显著下调表达，最高下调约90倍（图2-A）；而Bmcat基因在球孢白僵菌侵染家蚕早期（6～12 h）上调表达（约上调6倍），在感染后期（约36 h-家蚕死亡），则显著下调表达（图2-B）。实验结果说明球孢白僵菌在感染家蚕过程中可能通过调节家蚕SOD、CAT等抗氧化酶基因的表达水平来影响家蚕的抗氧化体系。

2.2 家蚕5龄幼虫感染球孢白僵菌后组织中抗氧化水平的变化

为进一步说明球孢白僵菌对家蚕抗氧化体系的作用，分析了家蚕不同器官、组织中抗氧化水平的变化。结果表明，家蚕感染球孢白僵菌后，血淋巴、脂肪体、中肠和马氏管组织中总抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力均在感染初期略有升高（36～42 hpi），而后显著降低（48～72 hpi）（图3）。血淋巴总抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力均高于其他组织，其抗氧化活力对维持家蚕抗氧化平衡至关重要；而感染白僵菌后3个抗氧化指标分别下降76.1%（降幅188.3 U/mL）、84.0%（降幅184.7 U/mL）、73.6%（降幅187 U/mL）。脂肪体是家蚕重要的免疫和解毒器官，其中CAT酶活力下降幅度最大，下降77.7%（降幅146 U/mg）。中肠组织中总抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力均低于其他组织，而且白僵菌侵染后，酶活力下降幅度也低于其他组织，分别下降69.2%（降幅108.9 U/mg）、74.9% （降幅80.9 U/mg）、54.2%（降幅46.1 U/mg）。马氏管是重要的排泄器官，能够有效的排除多余的有毒有害物质；感染白僵菌后，其总抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力也显著降低，分别下降76.8% （降幅124.6 U/mg）、79.3%（降幅97.4 U/mg）、79.1% （降幅150.3 U/mg）。以上结果说明，白僵菌侵染家蚕后可能对家蚕各器官、组织造成损伤，严重破坏了家蚕的抗氧化平衡。

Bmsod和Bmcat是家蚕重要的抗氧化基因。白僵菌感染家蚕之后，Bmsod和Bmcat在脂肪体、中肠和马氏管组织中均显著下调表达，而在血淋巴中表达水平基本不变（图4）。Bmsod基因表达水平在脂肪体、中肠和马氏管组织中分别从48、54和60 hpi开始显著下调，下调约49.1倍、48.62倍和68.9倍。Bmcat基因在脂肪体、中肠和马氏管组织中分别从54、42、48 hpi开始显著下调表达，分别下调约36.2倍、29.8倍和38.5倍。以上结果说明，白僵菌侵染能够调节家蚕脂肪体、中肠和马氏管组织中抗氧化基因的表达水平，进而破坏抗氧化体系。

2.3 注射球孢白僵菌毒素对家蚕幼虫组织抗氧化水平的影响

家蚕5龄幼虫注射球孢白僵菌毒素后，血淋巴中和脂肪体中总抗氧化活力、SOD酶活力和CAT酶活力下降幅度较大，中肠和马氏管中3种抗氧化指标也有所下降（图5）。因此说明球孢白僵菌毒素是导致家蚕抗氧化体系破坏的主要因素。实时定量结果表明，注射毒素后，血淋巴中Bmsod基因和Bmcat基因表达水平基本不变；Bmsod在脂肪体、中肠和马氏管中均下调表达；而Bmcat基因在脂肪体中下调表达，而在中肠和马氏管组织中显著下调表达（图6）。说明球孢白僵菌毒素能够影响脂肪体、中肠和马氏管的抗氧化基因的表达，破坏这些器官的解毒和抗氧化功能。

2.4 体腔注射白僵菌毒素和外源抗氧化剂对家蚕幼虫存活率的影响

SOD和CAT能够结合并消除机体内的活性氧、过氧化物质等自由基，维持机体正常生理机能，是常见的天然抗氧化剂。存活率实验结果显示（图7），正常感染组所有家蚕幼虫在61 h全部死亡；注射毒素后，家蚕幼虫在56 h全部死亡，存活率曲线明显左移，说明添加毒素能够加速染病幼虫死亡；注射SOD和CAT外源抗氧化剂后，家蚕幼虫分别在添毒后69 h和65 h才全部死亡，存活率曲线比对照组显著右移，说明添加外源抗氧化剂能够延缓染病幼虫的死亡；而注射“毒素+SOD”和“毒素+CAT”后，家蚕幼虫分别在添毒后58 h和57 h全部死亡，存活率曲线较注射毒素组向右偏移，说明添加外源抗氧化剂能够消除毒素对蚕体的损伤作用。根据试验数据，应用SPSS19.0软件的Probit回归计算出各处理组的半数致死时间（LT50）（表2）。表2的数据说明，添加外源抗氧化剂均能消除毒素的损伤作用而延长LT50，其中SOD的作用（延长约6 h）强于CAT的作用（延长约2 h）。

2.5 毒素对家蚕细胞的影响

生命代谢的功能单位是细胞。向BmN细胞中添加球孢白僵菌毒素，观察毒素对家蚕细胞的损伤情况。添加白僵菌毒素后，家蚕BmN细胞发生凝集反应，胞质内液泡显著增加，最终全部崩解（图8）。此外，细胞总抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力以及Bmsod和Bmcat基因的表达水平在72 hpi之后显著下降（图9）。说明球孢白僵菌毒素能够直接作用于家蚕细胞，破坏抗氧化还原平衡，造成细胞自溶、崩解，进而可能损伤组织器官。

3 讨论

活性氧（Reactive oxygen species， ROS）是自由基的重要类别，由分子氧转化而来[15]。ROS主要包括超氧阴离子自由基、羟自由基（·OH）和过氧化氢（H2O2）等[16]。ROS极为活泼，具有较强的氧化能力，累积过多的ROS会导致氧化还原平衡失调，机体生理功能紊乱[17]。

机体内的ROS水平容易受环境因子的影响而失去平衡并过度累积，尤其是机体受到病原菌侵染时，产生呼吸爆发现象，导致超氧阴离子（O-2）、羟自由基（OH-）、过氧化氢（H2O2）和单线态氧（1O2）等多种活性氧产生和累积[15]。一方面，此类ROS能够参与吞噬作用，破坏已吞噬病原微生物细胞结构，进而杀死入侵病原微生物；另一方面，机体内积累过多此类具有较强反应特性的ROS，会破坏核酸、不饱和脂肪酸、功能蛋白等生物大分子的结构和功能，对宿主细胞造成严重的伤害[18]。

因此，生物体进化出一套完善的抗氧化系统，以维持体内的氧化还原平衡，以清除累积的自由基，避免机体受到氧化损伤[19]。机体的抗氧化系统由两部分组成：一类是非酶类抗氧化剂，主要包括谷胱甘肽（GSH）、一氧化氮（NO）、维生素C等具有还原作用的活性物质，在抗氧化系统中起到辅助作用；另一类是酶类抗氧化剂，主要包括超氧化物岐化酶（Superoxide dismutase， SOD）、过氧化物酶（Peroxidase， POD）、过氧化氢酶（Catalase， CAT）等，它们可以直接清除ROS，在抗氧化系统中起到主导作用[20-22]。本实验结果表明，家蚕感染球孢白僵菌后期，总抗氧化活力显著降低，表明ROS等自由基在感染后期显著增加。机体本应启动抗氧化系统以维持抗氧化还原平衡，但实验结果表明，SOD酶活力、CAT酶活力及其基因表达水平却在感染后期显著下调，说明蚕体感染白僵菌后抗氧化体系遭到破坏。

昆虫的中肠是阻止毒素、生物碱、糖苷类物质、槲皮素、黄酮类物质等次生代谢物质的第一道防线[23-24]；昆虫脂肪体是重要的免疫器官和重要的解毒器官，相当于哺乳动物的肝脏，它在清除自由基、抵御氧化损伤、降解次生代谢物质方面发挥着重要的作用[25]；昆虫的马氏管相当于哺乳动物的肾具有解毒功能，在解毒相关的超氧化物和次生代谢物质方面发挥着重要的作用[26-27]；昆虫血淋巴含有大量的抗氧化酶类和非酶抗氧化剂，在维持昆虫氧化还原平衡中起到重要作用[25]。家蠶感染球孢白僵菌后，血淋巴、中肠、马氏管和脂肪体的总抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力显著降低，而马氏管、脂肪体和中肠中相关基因的表达水平显著下调，说明球孢白僵菌可能攻击了家蚕的抗氧化、解毒器官，进而破坏了家蚕的抗氧化平衡。

球孢白僵菌在感染宿主昆虫后期会分泌真菌毒素等有毒代谢产物，破坏宿主昆虫的生理平衡，高浓度毒素可以直接导致昆虫死亡[7，28]。武艺等用活性炭吸附法从液态培养的球孢白僵菌菌丝代谢产物中提取了白僵菌毒素混合物，用此混合物添毒草地夜蛾[Spodoptera frugiperda（J. E. Smmith）]体外培养细胞后，发现细胞代谢紊乱，结构破坏，线粒体和核糖体损伤严重[12，29]。因此白僵菌毒素很可能是破坏家蚕抗氧化体系的重要因素。毒素注射实验结果表明，球孢白僵菌毒素也能够降低家蚕血淋巴、中肠、脂肪体的总抗氧化活力、SOD酶活力、CAT酶活力，马氏管、脂肪体和中肠中Bmsod和Bmcat基因也显著下调表达。因此，笔者推测球孢白僵菌可能通过分泌毒素破坏家蚕的抗氧化系统。

宿主昆虫抗氧化系统破坏会导致自由基过度累积，严重影响机体的生命代谢尤其是免疫力[17]。ROS能够与核酸的碱基发应，产生突变，引起碱基缺失或DNA断裂，影响免疫及生理代谢等相关基因的转录和翻译[17]。ROS能够与功能蛋白的氨基酸结合，改变蛋白空间结构或破坏活性中心，影响细胞的正常代谢和免疫防御能力[15]。ROS能够氧化宿主细胞膜上的寡糖链中糖分子的羟基碳，导致细胞自溶[30]。ROS能够攻击生物膜磷脂分子的不饱和脂肪酸，尤其是溶酶体膜破坏，释放酸性磷酸酶，严重损害细胞内的膜细胞器[30]。实验结果表明注射球孢白僵菌毒素后，家蚕幼虫存活率显著降低，而添加外源抗氧化剂能够消除毒素的损伤作用，显著延长幼虫的存活时间；家蚕BmN细胞添加球孢白僵菌毒素后发生凝集作用并最终崩解死亡，BmN细胞的总抗氧化活力和Bmsod和Bmcat基因表达水平也显著下调。因此笔者推测球孢白僵菌可能通过分泌毒素致死宿主昆虫，同时也能达到免疫逃逸的目的。

本研究结果表明，球孢白僵菌侵染家蚕幼虫后，可能通过分泌真菌毒素，攻击家蚕脂肪体、中肠、马氏管等解毒、抗氧化器官或组织，下调抗氧化基因表达水平，降低抗氧化酶活力，细胞过度积累活性氧等自由基而凋亡、崩解，使各器官、组织受到严重氧化损伤，导致生命活动紊乱，直至死亡；同时家蚕免疫系统破坏，有利于球孢白僵菌菌丝的生长和侵染，加速家蚕死亡；而球孢白僵菌毒素受体和调节抗氧化基因表达水平的分子机理还需深入研究。本研究阐释了球孢白僵菌侵染家蚕的致病机制可能是真菌毒素导致抗氧化平衡的破坏，研究结果为生防制剂的优化和家蚕抗性品种的选育提供了新的研究途径。

参考文献

[1] Tamayo-Mejía F， Tamez-Guerra P， Guzmán-Franco A W， et al. Developmental stage affects survival of the ectoparasitoid Tamarixia triozae exposed to the fungus Beauveria bassiana[J]. Biological Control， 2016， 93： 30-36.

[2] Zhang H， Wu S， Xing Z， et al. Bioassay and scanning electron microscopic observations reveal high virulence of entomopathogenic fungus Beauveria bassiana， on the Onion maggot（Diptera： Anthomyiidae） adults[J]. Journal of Economic Entomology， 2016， 109： 2 309-2 316.

[3] Ortiz-Urquiza A， Keyhani N O. Molecular genetics of Beauveria bassiana infection of insects[J]. Advances in Genetics， 2016， 94： 165-249.

[4] Tafoya F， Zun～igadelgadillo M， Alatorre R， et al. Pathogenicity of Beauveria bassiana（Deuteromycota： Hyphomycetes） against the Cactus weevil， Metamasius spinolae（Coleoptera： Curculionidae） under laboratory conditions[J]. Florida Entomologist， 2004， 87：533-536.

[5] Valero-Jiménez C A， Wiegers H， Zwaan B J， et al. Genes involved in virulence of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2016， 133： 41-49.

[6] Silvana P， Costa E M， Cristina P F， et al. Beauveria bassiana： quercetinase production and genetic diversity[J]. Brazilian Journal of Microbiology， 2011， 42： 12-21.

[7] Vikhe A G. In vitro and in vivo induction， and characterization of toxins isolated from Beauveria bassiana[J]. International Journal of Pure and Applied Bioscience， 2016， 4： 97-103.

[8] Ortiz-Urquiza A， Riveiro-Miranda L， Santiago-Alvarez C， et al. Insect-toxic secreted proteins and virulence of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2010， 105： 270-278.

[9] Lobo L S， Luz C， Fernandes E K， et al. Assessing gene expression during pathogenesis： use of qRT-PCR to follow toxin production in the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana during infection and immune response of the insect host Triatoma infestans[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2015， 128： 14-21.

[10] Geng T， Huang Y， Hou C， et al. Inductive expression patterns of genes related to toll signaling pathway in silkworm （Bombyx mori） upon Beauveria bassiana infection[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology， 2016a， 19： 861-868.

[11] Geng T， Lv D D， Huang Y X， et al. JAK/STAT signaling pathway-mediated immune response in silkworm （Bombyx mori） challenged by Beauveria bassiana[J]. Gene， 2016b， 595： 69-76.

[12] Wu Y， Huang X， Deng J， et al. Isolation， detection toxicity and structure of toxin from Beauveria bassiana[J]. Acta Microbiologica Sinica， 1998， 38： 468-474.

[13]高 英， 薛皎亮， 范三紅， 等. 布氏白僵菌代谢毒素的分离纯化及其对油松毛虫幼虫的毒性研究[J]. 中国农业科学， 2010， 43： 3 125-3 133.

[14] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-delta delta C（T））[J]. Methods， 2001， 25： 402-408.

[15] Turrens J F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species[J]. Journal of Physiology， 2003， 552： 335-344.

[16] Thannickal V J， Fanburg B L. Reactive oxygen species in cell signaling[J]. American Journal of Physiology Lung Cellular & Molecular Physiology， 2000， 279： 1 005-1 028.

[17] Apel K， Hirt H. Reactive oxygen species： metabolism， oxidative stress， and signal transduction[J]. Annual Review of Plant Biology， 2004， 55： 373-399.

[18] Kumar S， Christophides G K， Cantera R， et al. The role of reactive oxygen species on plasmodium melanotic encapsulation in Anopheles gambiae[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2003， 100： 14 139 -14 144.

[19] Ha E M， Oh C T， Ryu J H， et al. An antioxidant system required for host protection against gut infection in Drosophila[J]. Developmental Cell， 2005， 8： 125-132.

[20] Krishnan N. Compartmentalization of oxidative stress and antioxidant defense in the larval gut of Spodoptera littoralis[J]. Archives of Insect Biochemistry & Physiology， 2010， 63： 1-10.

[21] Yamamoto K， Banno Y， Fujii H， et al. Catalase from the silkworm， Bombyx mori： gene sequence， distribution， and overexpression[J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology， 2005a， 35： 277-283.

[22] Yamamoto K， Zhang P， Banno Y， et al. Superoxide dismutase from the silkworm， Bombyx mori： Sequence[J]. Distribution， and Overexpression， Bioscience Biotechnology & Biochemistry， 2005b， 69： 507-514.

[23] Yu H， Wang X， Xu J， et al. TRAQ-based quantitative proteomics analysis of molecular mechanisms associated with Bombyx mori（Lepidoptera） larval midgut response to BmNPV in susceptible and near-isogenic strains[J]. Journal of Proteomics， 2017， 165： 35-50.

[24] 耿 濤， 黄玉霞， 侯成香， 等. GSTs和GSH-Px在家蚕幼虫抵御球胞白僵菌感染过程中的作用[J]. 基因组学与应用生物学， 2016， 12： 3 335-3 343.

[25] Li Z H， Pan G Q， Ma Z G， et al. Comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins in the Bombyx mori fat body during the microsporidia（Nosema bombycis） Infection[J]. Journal of Invertebrate Pathology， 2017， 149： 36-43.

[26] Dow J A T， Davies S A. Insights into the malpighian tubule from functional genomics[J]. Journal of Experimental Biology， 2009， 212： 435-445.

[27] Mallikarjun G， Neetha N K， Manjunatha B， et al. A mini review of functional proteins in silkworm Bombyx mori L Haemolymph[J]. Indian Journal of Science & Technology， 2016， 9： 1-8.

[28] Yang Y T， Lee S J， Nai Y S， et al. Up-regulation of carbon metabolism-related glyoxylate cycle and toxin production in Beauveria bassiana JEF-007 during infection of bean bug， Riptortus pedestris（Hemiptera： Alydidae）[J]. Fungal Biology， 2016， 120： 1 236-1 248.

[29]Vemmer M， Schumann M， Beitzen-Heineke W， et al. Development of a CO2-releasing co-formulation based on starch， Saccharomyces cerevisiae and Beauveria bassiana attractive towards western corn rootworm larvae[J]. Pest Management Science， 2016， 72： 2 136 -2 145.

[30]Circu M L， Aw T Y. Reactive oxygen species， cellular redox systems， and apoptosis[J]. Free Radical Biology & Medicine， 2010， 48： 749-762.