毛竹4个miRNA在胚芽萌发过程的表达响应研究

黄志明 李晨曦 陈磊 江涛 苏军 冈义人 帅鹏

摘 要 为探究毛竹miRNA在种子萌发过程中相关调控机理，利用荧光定量和生物信息学技术分析毛竹中可能参与种子萌发调控的miRNA，并预测其潜在靶基因。并对毛竹种子萌发过程中胚芽萌发的不同阶段的miRNA及其潜在靶基因的表达模式进行验证分析。结果显示，毛竹4个miRNA基因（phe-miRNA156k、phe-miRNA159b、phe-miRNA160a 和phe-miRNA396e）在种子萌发至形成完整胚芽的3个阶段中表达水平呈上升趋势。通过miRNA及其靶基因的表达关联分析，发现毛竹这4个miRNA潜在靶基因（phe-miRNA156-T1、phe-miRNA156-T2、phe-miRNA159-T1、phe-miRNA160-T1、phe-miRNA396-T1和phe-miRNA396-T2）的表达下调，而这些靶基因可能参与调节毛竹种子萌发、细胞分化和器官形成等过程。其中根中高表达的phe-miR396e随着毛竹萌发而上调表达，其靶基因则表达下调，它可能通过抑制其2个生长因子相关蛋白的靶基因来实现对毛竹萌发过程的调控。由此表明，这4个毛竹miRNA在胚芽萌发过程可能具有重要作用，研究结果对进一步发展毛竹分子育种提供一定理论参考。

关键词 毛竹；miRNA；胚芽萌发

中图分类号 S795 文献标识码 A

Abstract In order to study the role of microRNAs during the process of seed germination and embryo morphogenesis in moso bamboo[Phyllostachys edulis（Carr.）H. De Lehaie]， bamboo miRNAs and their putative targets were found and predicted through the bioinformatics analysis and RT-qPCR results. And the expression pattern of miRNA during different germination stages were analyzed and verified. The results showed that the phe-miRNA156k， phe-miRNA159b， phe-miRNA160a and phe-miRNA396e had a rising expression trend during three stages of the seed germination. Through the association analysis between miRNA and their targets， we found that the 4 miRNAs are mainly negatively regulate their potential target genes phe-miRNA156-T1， phe-miRNA156-T2， phe-miRNA159b-T1， phe-miRNA160-T1， phe-miRNA396-T1 and phe-miRNA396-T2. And these target genes were predicted to be probably participated in the progress of bamboo seed germination， cell differentiation and the formation of organs and other life activities. In addition， phe-miR396e that with a high expression level in root and its target genes showed simultaneous up- and down-regulation of expression during bamboo seed germination. Phe-miR396e maybe achieve control of the process of bamboo germination through inhibit its two target genes which related to growth factor. These results showed that these four miRNAs might plays an important role in bamboo germination and may provide reference for further studies of the bamboo molecular breeding.

Key words Moso bamboo（Phyllostachys edulis）； miRNA； embryo morphogenesis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.019

毛竹[Phyllostachys edulis（Carr.）H. De Lehaie]是禾本科竹亞科刚竹属的一种散生竹种。其生长快速、材性优良、产量高、用途广泛，是非常重要的森林非木质利用资源。在我国，毛竹林面积占全国总竹林面积的约70%，是中国竹林中分布范围最广、面积最大的竹种[1-3]。毛竹的开花结实习性奇特，其开花周期长、难以预测，终身开花一次并在种子发育成熟后死亡，且开花零散，自然结实率低，质量差，种子寿命短[4-5]。由于毛竹种子采收难、保存难、发芽率低，使得利用种子培育实生苗的研究和应用受到了很大的限制。因而，研究毛竹种子的萌发、生长和发育等过程中的相关机制，对毛竹育种和竹林培育具有重要意义。

种子在适宜条件下，幼胚恢复生长，细胞基本代谢活动开始运转，形成新的组织和器官，形态建成逐步完成[6]。从分子生物学角度来看，种子的萌发处处都受到相关基因的调控。开展种子萌发相关的分析特别是在分子层面进行相关的研究，对于指导毛竹实生苗培育和造林工作具有良好的生产实践意义和借鉴作用。

miRNA是一类约21个核苷酸长度的非编码小分子RNA，广泛存在于动物、植物以及一些病毒中[7]。miRNA主要通过碱基互补原则切割靶基因mRNA或抑制其翻译来实现对靶基因的负调控功能[8]。在植物体内，miRNA对叶片形成，根系发育以及成花过程等发育过程起着重要的调控作用[9]。Wang等[10]在玉米中发现种子萌发的早期，miRNA166、miRNA156和miRNA528都呈现较高的表达量，可能调控种子的萌发过程[10]。同时，有研究报道，拟南芥miRNA159与种子萌发过程中ABA响应的正向调控因子MYB33和MYB101在种子的休眠和萌发过程中的表达存在一定联系[11]。miRNA396 （ath-miR396a-3p）则其主要通过抑制生长调控因子的表达来参与植物的生长发育各个阶段的调控[12]。Hu等[13]对百脉根种子萌发时miRNA的表达情况的研究发现，miR156、miR160和miR399的表达水平显著升高，结合Martin等对西红柿种子萌发的相关研究结果，可推断出上述miRNA对种子萌发可能起到重要作用[13]。

近年来高通量测序技术的兴起使得大规模的发掘并鉴定毛竹miRNA成为可能。Xu等[14]利用高分辨率的测序接头，在毛竹根和叶中鉴定并证实了5个新的miRNA。He等[15]在毛竹发育的茎中进行miRNA研究，鉴定出大量可能参与速生过程的miRNA基因。Gao等[16]通过二代测序技术对毛竹不同开花时期的miRNA进行比较，发现毛竹miRNA在花发育过程中的作用。王丽丽等[17]发现毛竹miR164b对靶基因PeNAC1的调控，与毛竹在应对不同非生物胁迫过程密切相关。而且毛竹miR397 和miR1432 随着光照、干旱等胁迫以及激素（ABA 和GA3）处理响应表达，这些miRNA可能在毛竹应对非生物胁迫中起重要作用[18]。这些毛竹miRNA的发掘和鉴定为本研究提供可靠的基础。

本研究主要关注miR156、miR159、miR160和miR396这4个miRNA及其靶基因在毛竹种子萌发过程中胚芽内的表达情况。同时研究毛竹实生苗根茎叶三部位中这4个miRNA及其靶基因的表达水平情况。初步探究毛竹胚芽萌发、生长过程相关响应的miRNA及其靶基因可能的调控机制。

1 材料与方法

1.1 材料

以福建省林业科学院提供的当年采收的毛竹种子为材料，毛竹种子剥去种壳，用清水浸泡过夜，自来水冲洗2 h去除残留杂质，然后用0.1%的高锰酸钾溶液消毒1 h，蒸馏水冲洗干净后置于无菌滤纸上，以适量蒸馏水在黑暗条件下进行萌发，每日观察记录毛竹种子萌发状态。依据种子胚芽萌发的状态将毛竹种子的萌发过程分为胚芽萌发第1阶段（7 d）、胚芽萌发第2阶段（15 d）和胚芽萌发第3阶段（21 d）。分别取3个萌发阶段完整的毛竹胚芽，迅速置于液氮中冷冻，然后-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 miRNA成熟體序列获得 通过同源序列比对并参考现有毛竹miRNA研究[19]，从毛竹基因组数据库BambooGDB： Bamboo Genome Database（http：//www.bamboogdb.org/）中获取miRNA成熟体序列，筛选所得miRNA序列为：phe-miR156k：5'- UUGACAGAAGAGAGUGAGCAC-3'；phe-miR159b：5'-UUGGAUUGAAGGGAGCUCUC-3'；phe-miR160a：5'-UGCCUGGCUCCCUGUAUGCCA-3'；phe-miR396e：5'-UCCACAGGCUUUCUUGAACUG-3'。

1.2.2 miRNA前体及启动子序列的预测分析 用miRNA成熟序列比对毛竹的基因组序列，利用在线预测软件RNAfold（http：//www.tbi.univie.ac.at/RNA/）预测分析其二级结构，得出毛竹4个miRNA成熟体的前体序列。从毛竹基因组数据库上下载前体序列的上游1 500 bp序列，利用在线平台Plant CARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行前体上游启动子区的作用元件及其功能预测分析。

1.2.3 miRNA 靶基因预测 利用植物小RNA靶基因分析服务器psRNATarget将4个毛竹miRNA 成熟体序列（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/），与毛竹CDS数据库进行比对。运算中的最大期望值（Maximum expectation）设置为3，其他值设为默认值进行miRNA靶基因预测。从毛竹基因组数据库下载潜在靶基因序列，分析miRNA对潜在靶基因的靶标作用位点及靶基因主要结构和功能。

1.2.4 miRNA成熟体和靶基因的qRT-PCR定量分析 用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根）提取毛竹种子萌发过程3个时期的胚芽样品总RNA，操作步骤参照说明书。用超微分光光度计（Nanodrop 2000）检测RNA的浓度和质量。将总RNA用Mir-X miRNA First-strand synthesis Kit试剂盒加PolyA尾并反转录（Clontech）获取cDNA，将cDNA稀释10倍后用于miRNA定量分析。反向引物用试剂盒中提供的通用引物，正向引物分别为：phe-miR156k： 5'-TTGACAGAAGAGAGTGAGCAC-3'；phe-miR159b：5'-TTGGATTGAAGGGAGCTCTC-3'；phe-miR160a：5'-TGCCTGGCTCCCTGTATGCCA-3'；phe-miR396e：5'-TCCACAGGCTTTCTTGAACTG-3'，选择U6作为内参基因。

对于miRNA靶基因的反转录，通过总RNA用PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒进行反转录，操作方法参考说明书。选择TIP41为内参基因[20]。应用定量引物设计网站Primer3web： （http：//bioinfo. ut.ee/primer3/）设计检测miRNA靶基因表达量的引物（表1）。实时荧光定量用的GoTaqR qPCR Master Mix（美国Promega）试剂盒在ABI-Q6仪器上进行定量分析。参照说明书进行反应体系配制，每个基因表达实验设计3次重复。

1.3 数据处理与分析

应用Excel 2010和Spss 19.0软件进行统计学分析，包括采用公式RQ=2-ΔΔCT进行miRNA及其可能靶基因相对表达水平的计算分析，采用双变量相关模式分析，选择Pearson相关指数和Spearman 相关系数同时进行4个miRNA及其对应靶基因的表达相关性分析。

2 结果与分析

2.1 毛竹種子胚芽萌发过程中miRNA的表达分析

通过对毛竹种子胚芽萌发3个不同阶段（7、15和21 d）的4个miRNA表达水平的监测，结果显示它们表达水平总体都呈现上升的趋势（图1）。其中，胚芽中的phe-miR156k和phe-miR160a的表达量在15 d时达到最高值，种子萌发的15 d到21 d期则略微有所下降。而胚芽中的phe-miR159b和在种子萌发15 d期，相较于萌发初期（7 d期），表达水平有明显的升高。它们在达到15 d期后总的表达量变化就呈现相对稳定。而phe-miR396e在毛竹种子胚芽萌发期间，表达水平一直呈稳步上升趋势，且直到21 d时才达到表达峰值。结果显示，在毛竹萌发时，这4个miRNA的表达量随着种子的萌发上调，该结果显示它们可能参与毛竹萌发过程基因的调控。

2.2 miRNA 启动子序列分析

过启动子分析软件，对4个miRNA的34个不同前体的上游启动子区域相关顺式调控元件进行分析（表2）。4个miRNA的潜在前体上游调控区均含有启动子基本作用元件，如TATA-box，CAAT-box。同时预测到的前体上游调控区存在调控分生组织发育、胚乳表达等相关的作用元件，以及光、激素响应相关的作用元件。其中，phe-miR159b的前体序列上游存在细胞周期调控相关的作用元件，phe-miR160a中则存在种子特异性相关的作用元件。

2.3 miRNA靶基因的预测

4个miRNA预测并根据错配值大小等条件优先筛选到8个靶基因（表3）。其中，phe-miR156k的靶基因是2个SBP家族的基因，功能预测显示其主要参与植物花的形成和后期发育[21]。Phe-miR159b 的1个潜在靶基因是MYB转录因子家族的基因，还预测到1个与种子萌发代谢相关的磷脂酶C相关的基因；phe-miR396e的2个靶基因具有生长调控因子的功能，预测显示主要参与叶片和根系的发育形成。phe-miR160a的2个靶基因具有响应生长素的功能。

2.4 毛竹种子胚芽萌发过程中miRNA靶基因的表达

通过qRT-PCR技术检测了所预测到的8个靶基因在毛竹胚芽萌发过程中的3个不同时期的表达分析。在这8个靶基因中，只有2个基因（phe-miR159-T2和phe-miR160-T2）在萌发过程中上调表达，而其他6个miRNA的相应靶基因则是下调表达。靶基因phe-miR159b-T2在15 d时开始响应萌发过程，而phe-miR160-T2在7 d时已经开始上调表达。在6个下调表达的靶基因中，有2个靶基因（phe-miR156-T2和phe-miR160-T1）是随着萌发的整个过程下调表达。而其他4个下调的靶基因则是在7 d期开始下调表达，而到15 d期表达则趋于平稳直至21 d期（图2）。

胚芽萌发的3个时期miRNA的表达分析可发现，表达量的变化总体呈一定的趋势，通过相关性分析发现，在毛竹种子萌发过程中，4个miRNA在胚芽的表达水平和它们的潜在靶基因的表达水平总体上（5/8）是呈显著负相关（表4），而其中的phe-miR159-T2和phe-miR160-T2两个miRNA和靶基因对不符合负相关特征。结合Pearson相关性指数和spearman相关性指数分析，phe-miR159与其潜在靶基因phe-miR159-T1的表达水平显著负相关。同时，phe-miR156与其2个潜在靶基因以及phe-miR396与潜在靶基因phe-miR396-T1、phe-miR396-T2的表达水平之间的相关性也较为显著。

毛竹生长过程中，种子萌发，发育，生长、各细胞分化形成不同组织器官，长成毛竹实生苗。其中，具有丰富居间分生组织的毛竹茎和主要进行光合作用的毛竹叶子，以及不断向地下延生快速生长的毛竹根系是毛竹实生苗的三大重要部位。

2.5 毛竹实生苗不同部位miRNA的表达

4个miRNA在毛竹的根、茎、叶3个不同部位的表达水平都呈现差异，其中叶片中4个miRNA的表达水平差异最为显著（图3）。phe-miR396e在3个部位中都具有最高的表达水平。同时，同一个miRNA在毛竹实生苗的不同组织中的表达水平也呈现差异。phe-miR156k和phe-miR159b的表达水平在茎中表达量最低，而phe-miR160a和phe-miR396e的表达水平于叶中最低，4个miRNA的表达量在毛竹实生苗的根中呈最高值。

3 讨论

毛竹产量的需求日益增大使得人们对毛竹发育生长的调控机制越来越重视，这是培育高产、速生毛竹品种的前提条件之一。本研究对毛竹4个miRNA的表达分析发现它们在萌发过程中，根中的表达量均高于在茎和叶中的表达量。这可能与生长初期毛竹需要集中大量能量来生根有一定的关系，深入土壤的扎根有利于叶片及植株整体对于土壤无机营养的获取。而经预测这4个miRNA与根生长具有一定的关系。例如在根中高表达量的miR396的拟南芥同源基因参与根中干细胞和增殖细胞转换过程，在根中具有重要的调控功能[22]。

对于4个miRNA启动子分析中发现含有大量与GA3、ABA、生长素等激素及植物分生、分化相关的作用元件。这表明它们在毛竹生长发育过程中可能参与到激素的调控过程。在拟南芥中，miR159被证实受到ABA的诱导而表达，并在种子萌发过程中调控下游靶基因MYB转录因子的表达[11]。本研究中毛竹phe-miR159b启动子中发现可能的ABA响应元件且在种子萌发中表达上调，说明毛竹phe-miR159b可能也在毛竹种子受ABA调控的过程中起一定的调控作用。

植物miRNA的表达具有一个复杂的调控网络，通常是抑制其靶基因的表达得以实现。miR156表达水平在胚芽发育中后期显著上升，其靶基因phe-miR156-T1和phe-miR-156-T2都呈表达水平下降趋势，miRNA和靶基因的表达呈显著负相关。拟南芥miR156通过调控SPL3的表达来实现幼体到成体的转变[23]，而本研究中miR156也与毛竹SPL家族的2个靶基因在表达趋势上具有一定的相关性。通过功能预测分析显示，phe-miRNA159b 的潛在靶基因phe-miR159-T2是磷酸酯酶C相关的基因，其表达水平在胚芽生长第3阶段明显上升，phe-miRNA159b可能通过正向调控作为浆胞膜上的关键酶的基因，从而对细胞的分裂和细胞的代谢活动进行产生重要意义。毛竹胚芽发育过程中，phe-miRNA396e基因的表达水平不断增加，其两个靶基因的表达水平都呈现与miRNA成熟体表达水平的显著负相关。这种表达模式与目前大部分基于miR396的研究结果相似。在叶子发育中miR396的表达量随叶龄的增长而增加[22]。且有研究表明miR396通过负调控GRF，抑制细胞分裂由此调控植物的生长发育[24-26]。

在本研究中有两个靶基因与其上游miRNA的表达模式一致，同时在毛竹萌发过程中表达上调。该结果并未符合传统的miRNA表达上调后会使其靶基因相应的表达下调，这可能是由于miRNA在对部分靶基因调控是只是起微调的作用或者是由于其对靶基因调控上起到增强子调节器的作用[27]。

综上，通过初步对4个毛竹miRNA表达进行研究，发现它们可能参与到毛竹种子萌发过程，但仍需要对它们靶基因的功能验证进行深入分析。本研究中发现phe-miR396e在根中高表达且随着毛竹萌发而上调表达，它可能通过抑制其两个生长因子相关蛋白的靶基因来实现对毛竹萌发过程的调控。越来越多的miRNA在毛竹种子萌发过程的深入研究，将有可能揭示其内在的调控网络，将使得毛竹的分子育种成为可能。

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