白芨种子萌发及其原球茎高效增殖体系建立

刘敏　舒雨婷　张玉琼　郭畅　徐国力　高俊山

摘要：【目的】筛选白芨原球茎诱导和增殖的最适培养基，建立白芨原球茎高效增殖体系，为白芨种苗工厂化组培生产提供技术支持。【方法】以白芨种子为外植体，筛选适宜其无菌萌发的灭菌方法；以MS或1/2MS为基本培养基，添加不同浓度的植物生长物质和附加物，通过单因素试验，确定最佳光照和温度条件，筛选最适合其原球茎诱导的培养基；通过正交试验，筛选最适合其增殖的培养基。【结果】采用75%乙醇处理白芨蒴果10 min，无菌萌发率达90.0%，且种子萌发不受影响。在原球茎诱导过程中，30.0μmol/m²·s光照强度和25℃温度环境有利于原球茎诱导；最适合原球茎诱导的培养基为1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。在原球茎增殖过程中，添加土豆泥、椰子汁、香蕉泥等附加物对原球茎增殖有益，其中添加50.0g/L土豆泥的增殖效果最佳。正交试验结果表明，原球茎增殖的最佳培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50.0 g/L土豆泥，增殖倍数达5.270。【结论】建立的白芨原球茎高效增殖体系可在白芨种苗工厂化组培生产中推广应用。

关键词：白芨；种子萌发；原球茎诱导；增殖体系

中图分类号：S567.23 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）12-2223-05

0引言

【研究意义】白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]亦称甘根、良姜等，是兰科（Orchidaceae）白芨属（Bletilla）多年生草本植物，喜潮湿，原产于我国长江流域（中国植物志编辑委员会，2004），安徽省是白芨主产大省。白芨为传统中药，性微寒，味苦涩，可用于止血敛疮、消肿生肌（李雨晴等，2015），《中华人民共和国药典》（中国药典委员会，1995）亦有收载，可用于治疗各种出血、疼痛及皲裂等。此外，白芨花大而艳丽，株形优雅，可作为性状极佳的地被植物和景观植物，其根状茎中的白芨胶可应用于化妆品。由于白芨种子萌发率低、自然增殖缓慢，限制了白芨资源的开发利用，使白芨供需矛盾日趋突出，也严重威胁到白芨自然资源的保护。为了减轻对白芨野生资源的依赖，满足生态绿色发展与林下经济发展的需要，人工繁育白芨势在必行。植物组培能快速繁衍大批种苗，且兰科植物原球茎繁衍增殖技术已较成熟，但目前白芨原球茎的增殖系数仅2.00～3.00，与同为兰科植物的蝴蝶兰相差甚远，难以满足市场需求。因此，优化白芨原球茎诱导培养条件及扩大原球茎增殖倍数，对提高其快繁培养效率具有重要意义。【前人研究进展】管常东等（2010）研究发现，白芨种子十分细小又无胚乳，在自然条件下萌生艰难，需在潮湿的苔藓上才能发芽；传统的白芨栽培主要通过分株繁衍，耗时久、效果差，且材料消耗大，难以满足大批量栽培需要。近年來，国内外正在探索白芨的组培技术，以实现人工种植，减少对野生资源的依赖。叶静等（2010）研究认为，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+1.0%活性炭最适合白芨种子萌发；MS+1.0 mg/L 6-BA+0.15 mg/L NAA最适宜白芨丛生芽增殖。赵漫丽等（2011）研究认为，最适合白芨种子萌发的培养基为MS+1.0～3.0 mg/L 6-BA+I.0 mg/L NAA+3.0 g/L碳粉；最适合白芨继代增殖的培养基为MS+1.0～2.0mg/L 6-BA+2.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+4.0 g/L琼脂+15.0 g/L魔芋粉；最有利于白芨生根的培养基为1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+I.5 mg/L NAA+1.5 mg/LIBA+70.0 g/L香蕉泥。李慧敏等（2013）研究发现，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L NAA+附加物最适合白芨假鳞茎诱导。叶秀仙等（2015）研究发现，较适宜素心建兰种子无菌萌发的培养基为1/2MS+0.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2.0 g/L水解蛋白+1.0 g/L活性碳+30.0 g/L蔗糖。易双双等（2016）研究发现，最适宜树兰的增殖培养基为MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，增殖系数为5.20。【本研究切入点】目前，针对建立白芨原球茎高效增殖体系的研究未见报道。【拟解决的关键问题】以白芨种子为外植体，筛选安全简便高效的灭菌方法；优化种子萌发和原球茎诱导的环境因子，筛选最适宜原球茎诱导和增殖培养基，提高白芨原球茎增殖系数，建立白芨原球茎高效增殖体系，为白芨组培苗的规模化生产提供技术支持。

1材料与方法

1.1试验材料

供试白芨果荚饱满未破裂，颜色均匀且品质优良，产自湖北宜昌远安县。

1.2试验方法

1.2.1灭菌方法筛选 将白芨蒴果用自来水冲洗30 min，用洗洁精清洗蒴果表面，然后随机分成3个处理，处理1蒴果先用75%乙醇浸泡30～45 s，然后用0.1%升汞消毒8～10 min，无菌水冲洗5-8次，无菌滤纸吸干表面水分；处理2蒴果在75%乙醇中浸泡10min，取出后置于超净工作台上吹干；处理3蒴果用10%次氯酸钠消毒8～10 min，然后用无菌水冲洗5～8次，无菌滤纸吸干表面水分。各处理均浸泡8个蒴果，浸泡液没过蒴果。随后剖开果荚将种子接种于1/2MS培养基中，每处理组接种20瓶，每组6次重复，培养7 d后统计污染数，计算无菌萌发数和萌发率。

无菌萌发数=总瓶数-污染数-不萌发数

萌发率（%）=无菌萌发瓶数/总瓶数×100

1.2.2原球茎诱导培养基筛选 以1/2MS和MS为基本培养基，添加不同浓度6-BA和NAA组成8个培养基配方，筛选出白芨原球茎诱导的最佳植物生长物质组合。

1.2.3原球茎诱导环境因子筛选 以1/2MS为基本培养基，分别添加1.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA，置于光照强度梯度为黑暗、10.0μmol/m²·s、20.0μmol/m²·s和30.0μmol/m²·s及温度梯度为10、15、20和25℃等条件下进行单因素试验，筛选出原球茎诱导的最佳条件。

1.2.4原球茎增殖培养基筛选 分别以1/2MS、3/4MS和MS为基本培养基，添加0.5、1.0、1.5 mg/L 6-BA和0.1、0.2、0.3 mg/L NAA及50.0 g/L香蕉泥、土豆泥和椰子汁，通过正交试验设计（表1），筛选出白芨原球茎增殖系数最高的培养基配方。

培养条件：选择形态大小相近、未开裂的白芨蒴果，灭菌后将果荚内的种子接入不同设置的培养基，各组处理均添加7.8 g/L琼脂粉和30.0 g/L蔗糖，并将pH调整为5.8～6.0，每天光照14 h。

1.3统计分析

试验数据采用Excel 2010和SPSS 18.0进行统计分析。

2结果与分析

2.1不同灭菌方法对白芨种子萌发的影响

从表2可看出，白芨果荚3种灭菌处理方式的污染率存在显著差异（P<0.05，下同），其中处理2的灭菌效果最好，无菌萌发率达90.0%，显著高于处理1和处N3。综合考虑操作简便、成本较低及环境友好等因素，后续试验选择处理2灭菌方法进行灭菌。

2.2不同基本培养基和植物生长物质浓度配比对白芨原球茎诱导的影响

从表3可看出，不同配方培养基对白芨原球茎诱导效果明显不同，以1/2MS培养基中原球茎诱导萌发和生长速度较快，其中又以1号培养基的培养效果最佳，培养约17.00 d即萌发，萌发两周见绿，且颜色很深，说明较低浓度的植物生长物质组合（1.0 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA）有利于白芨原球茎诱导和生长。

由表4可知，基础培养基类型、6-BA和NAA浓度对白芨原球茎的诱导均有极显著影响（P<0.01，下同），以基础培养基类型和6-BA浓度的影响更突出。

综合分析白芨种子的萌发时间和生长情况，在培养基1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA中，白芨原球茎的诱导速度最陕，长势最佳。

2.3不同光照强度对白芨原球茎诱导的影响

由表5可知，不同光照强度对白芨原球茎诱导存在显著影响，在一定范围内光照强度提高有利于白芨原球茎诱导，其中光照强度为30.0μmol/m²·s时白芨原球茎诱导效果最佳，种子萌发时间最短（仅20.00 d），原球茎长势极佳，而黑暗处理的白芨种子几乎不萌发，处理50 d后转入光照条件下培养可萌发。

2.4不同温度对白芨原球茎诱导的影响

由表6可知，不同温度对白芨原球茎诱导存在显著差异，低温延缓白芨种子萌发和原球茎形成，适宜温度对原球茎的诱导较有利，在20～25℃时种子萌发及原球茎形成更快，以25℃为白芨原球茎诱导最佳温度，诱导23.00 d原球茎即萌发，且长势极佳。

2.5不同培养基对白芨原球茎增殖的影响

从表7可看出，不同培养基配方对白芨原球茎增殖效果的影响明显不同。其中，MS培养基中添加0.5 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA和50.0 g/L土豆泥，白芨原球茎的增殖倍数达5.270。正交试验结果表明，培养基成分对原球茎的增殖倍数有显著影响，其中，最佳基本培养基类型为MS培养基，最佳6-BA浓度为0.5 mg/L，最佳NAA浓度为0.2 mg/L，最有利于原球茎增殖的附加物为50.0 g/L土豆泥。综合考虑，原球茎增殖的最佳配方为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA+50.0 g/L土豆泥。

3讨论

本研究探索不同灭菌方法、基本培养基、环境因素、植物生长物质和附加物等对白芨原球茎诱导和增殖的影响，筛选适合原球茎诱导和增殖的最佳培养基，以构建白芨原球茎高效增殖体系。其中，75%酒精灭菌方式操作环节少，对白芨无毒害作用，灭菌效果（灭菌率达90.0%）优于次氯酸钠和升汞。Thompson等（2006）研究发现，对多种非洲兰科植物果实最适宜的灭菌方法是先喷洒75%酒精，再用1.75%次氯酸钠和1%吐温-20灭菌20 min，然后用1%苯菌灵消毒10 min，最后用无菌水冲洗，灭菌率达65%以上，灭菌效果较本研究差。胡琦敏等（2016）研究表明，最适合兰科植物灰岩金线莲蒴果的灭菌方法是0.1%升汞浸泡20 min，种子萌发率最高，但灭菌方法比本研究繁琐，耗时较长。

管常东等（2010）研究发现，MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA是白芨原球茎诱导最适培养基，本研究结果与其相似，白芨原球茎诱导最适培养基为1/2MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。袁宁等（2009）研究认为，1/2MS+1.0 mg/L 6-BA是适宜白芨种子无菌萌发的培养基，种子在无菌播种约45 d时萌发，生长状态良好，但萌发时间比本研究长，可能与本研究中加入0.1 mg/L NAA并在光照下培养可促进原球茎萌发生长有关。

本研究中，在30.0μmol/m²·s和25℃条件下白芨种子即可萌发，萌发后10.00 d即变绿，约20.00 d可见原球茎生长，而袁宁等（2009）对白芨种子采用20～25℃、暗培养条件，45 d左右种子才萌发，叶静等（2010）对白芨原球茎先进行暗培养5 d，20 d后变成绿色，27 d产生原球茎，33 d长出芽尖，结合本研究中暗培养50 d种子不萌发分析，光照是促进白芨种子萌发的重要条件。Thompson等（2006）在25℃和8.5μmol/m²·s光照下培养多种非洲兰科植物种子，种子萌发后生长状态良好，所使用的光照强度小于本研究，说明不同种兰科植物种子的无菌萌发可能需光程度不同，提供光照可明显缩短其萌发时间，加速原球茎形成进程。本研究中，白芨种子萌發和原球茎生长的较佳温度为20～25℃，与Jhompson等（2006）、袁宁（2009）的研究结果一致，可作为白芨原球茎规模化培养温度。

Jiang等（2011）研究发现，以独花兰嫩芽为外植体，在最佳增殖培养基1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA中增殖倍数为1.4-3.3。石云平等（2013）研究认为，MS+1.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L 2，4-D为最适宜增殖培养基，丛芽增殖倍数达2.88。本研究中，白芨原球茎增殖的最佳培养基为MS+0.5 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+50.0 g/L土豆泥，增殖倍数达5.270，明显高于上述研究结果，可能与适当降低植物生长物质浓度特别是NAA浓度及添加50.0 g/L土豆泥有利于原球茎增殖有关。本研究的增殖培养基可提高白芨原球茎增殖倍数，有利于白芨批量繁殖，可在工厂化生产中投入使用。

4结论

本研究建立的白芨原球茎高效增殖体系为：使用75%乙醇浸泡白芨果荚10 min消毒灭菌，以1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA为原球茎诱导培养基，以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+50.0 g/L土豆泥为增殖培养基。该体系可在白芨种苗工厂化组培生产中推广应用。