‘火焰’品种彩色马蹄莲组培快繁体系的建立及优化

张慧 罗珍珍 由翠荣 孔艳辉 解晓旭 孙印兵

摘要[目的]建立并优化‘火焰品种彩色马蹄莲组培快繁体系。[方法]以‘火焰品种彩色马蹄莲的球茎嫩芽为试验材料，对其组织培养无性繁殖体系进行研究。[结果]最佳诱导培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/LNAA；最佳增殖培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；植株再生最适合培养基为 1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；最适生根培养基为1/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭。[结论]该研究建立了‘火焰品种彩色马蹄莲的组培快繁体系，为其快速繁殖及产业化生产提供了技术和理论依据。

关键词‘火焰彩色马蹄莲；组培快繁；优化

中图分类号S682.2+64文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）16-0133-03

The Establishment and Optimization of Tissue Culture and Rapid Propagation System of Zantedeschia hybrida ‘Flame

ZHANG Hui1，LUO Zhenzhen1，YOU Cuirong2 et al（1.Yantai Landscape Scientific Institute，Yantai，Shandong 264000；2.College of Life Science，Yantai University，Yantai，Shandong 264005）

Abstract[Objective]To establish and optimze the tissue culture and rapiad progration system of Zantedeschia hybrida ‘Flame.[Method]The bulb shoots of Z.hybrida ‘Flame were used as experimental materials to study the system of tissue culture and rapid propagation.[Result]The optimal medium for induction was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The best proliferation medium was MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The most suitable plant regeneration medium was 1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The optimum rooting medium was 1/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 g/L activated carbon.[Conctustion]The tissue culture and rapid propagation system of Z.hybrida‘Flame was established to provide technology and the theoretical forndation for its rapid propagation and industrialized production.

Key wordsZantedeschia hybrida ‘Flame；Tissue culture and rapid propagation；Optimization

基金項目山東省科技发展计划项目（2013GNC11037）；烟台市科技发展计划项目（2015GNC113）

作者简介张慧（1985—），女，山东济南人，中级工程师，硕士，从事园林植物组织培养研究。

收稿日期2017-04-12

彩色马蹄莲（Zantedeschia hybrida）为天南星科马蹄莲属多年生草本植物，叶形奇特、花色艳丽，不论作为切花还是盆栽都有极好的观赏效果[1]。近年来，彩色马蹄莲已成为我国重要的新兴花卉品种，具有极大的市场发展潜力。传统上，彩色马蹄莲多采用播种法和块茎分割繁殖，周期长、繁殖系数低，在生产繁殖过程中易受环境因子的制约[2]。尤其是分生繁殖易诱发病毒病，导致种系退化、产量和品质下降，很难保持彩色马蹄莲原有的优良性状。组培离体快繁可以有效缩短繁育周期，节约成本，起到提纯复壮的作用，是实现产业化生产的有效途径。

国内外关于彩色马蹄莲离体快繁无性体系的建立已有较多研究与报道。1981 年Cohen等[3]成功地进行了马蹄莲的离体培养。国内，彩色马蹄莲首先于1988年在广西引种成功[4] ，我国对马蹄莲组织培养的研究起步较晚，最早于1989年由林荣等[5]报道了马蹄莲离体培养的成功，20世纪90年代末，李倩中等[6]、吴丽芳等[7]对彩色马蹄莲的组培方法进行了研究报道。2000年后关于彩色马蹄莲离体培养的研究越来越多，彭峰等[8]对‘冻糕的组培体系建立进行了研究；郑柱等[9]、张丽等[10]进行了黄色马蹄莲离体快繁及丛生芽诱导优化的研究；束晓春等[11]研究了不同的消毒方法和激素水平对‘柠檬品种彩色马蹄莲离体繁殖的影响；王伟英等[12]对‘高原品种彩色马蹄莲离体快繁各阶段的培养条件及激素进行了筛选。

‘火焰品种彩色马蹄莲，花色艳丽，黄中透红，犹如火焰，叶型优美，带有透明斑点，市场认可度极高，但关于此品种彩色马蹄莲离体快繁的报道较少，该试验在前人研究的基础上，对‘火焰品种彩色马蹄莲的丛生芽诱导、增殖、植株再生、生根及试管苗炼苗移栽等进行了进一步研究和优化，以期提出一套适宜该品种彩色马蹄莲组培快繁的简便快捷的方法，以指导产业化生产。

1材料与方法

1.1材料

供试植物为‘火焰品种彩色马蹄莲，自新西兰引进，以其球茎嫩芽为外植体，对其无性繁殖体系进行建立及优化。

1.2方法

该试验初培养诱导及不定芽增殖以MS为基本培养基，而植株再生及生根培养以1/2MS为基本培养基，添加琼脂粉5.8 g/L，蔗糖30 g/L，肌醇、酪蛋白各100 mg/L， pH为5.8，121 ℃/ 20 min高压灭菌。培养室温度为（25±1）℃，相对湿度一般保持在70%～75%，光照强度为2 000～3 000 lx，光照周期为每天16 h。

1.2.1不同6-BA浓度对初代丛生芽诱导的影响。

‘火焰品种球茎嫩芽外植体，先用3 g/L 50%多菌灵可湿性粉剂浸泡12～18 h，再选取球茎上的嫩芽，切成长度约1 cm的小块，在中性洗涤剂溶液中浸泡15 min，流水冲洗1 h，无菌滤纸吸干材料表面水分后，放入无菌瓶中，用0.1% HgCl2溶液浸泡7 min，再用2% NaClO溶液灭菌10 min，无菌水冲洗5次，每次5 min。将灭菌后的球茎嫩芽切成0.5 cm左右，接种在NAA浓度为0.2 mg/L，6-BA浓度分别设置为1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L的诱导培养基上，每瓶接种2块，每个处理接种15瓶，先暗培养20 d，再进行光照培养，培養45 d统计并计算丛生芽诱导率。

1.2.2不同6-BA浓度对丛生芽继代增殖的影响。

将各品种彩色马蹄莲初代培养得到的丛芽块分割为约0.5 cm×0.5 cm的小块，接种于不同6-BA浓度的MS培养基中，设置6-BA浓度为1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L，添加NAA（0.2 mg/L），每个处理接种10瓶，每瓶6块，设3次重复。光照培养30 d后，统计不定芽增殖面积、增殖倍数以及大于1 cm的植株数。

1.2.3不同6-BA浓度对不定芽植株再生的影响。

将丛芽块分割为约0.5 cm×0.5 cm的小块，以1/2MS为基本培养基，添加NAA（0.2 mg/L），分别设置6-BA浓度为0（CK）、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L，每个处理接种10瓶，每瓶6块，设3次重复。光照培养45 d后，统计不定芽增殖面积、增殖倍数以及大于1 cm的植株数。

1.2.4不同活性炭浓度对再生植株生根的影响。

选取高度均匀、生长良好、约3 cm的植株，以1/2MS为基本培养基，添加NAA（0.2 mg/L），设置活性炭浓度0（CK）、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L，每个处理接种10瓶，每瓶6块，设3次重复。培养30 d后统计各植株的生根数，调查株高。

1.3数据分析试验所得数据采用SPSS软件进行单因素或两因素方差分析，并采用LSD、Duncans新复极差法等检测各处理组间试验结果的差异显著性。

2结果与分析

2.1不同6-BA浓度对初代丛生芽诱导的影响

‘火焰品种球茎嫩芽外植体经45 d初代培养，在添加不同6-BA浓度的培养基中均可诱导形成丛生芽和愈伤组织。由表1可知，当6-BA浓度为1.0 mg/L时，诱导出的愈伤组织和丛生芽都极少且黄化；平均丛生芽诱导率在添加2.0 mg/L 6-BA培养基中最高（29.6%），该浓度下丛生芽浓绿健壮，生长状况最好；而6-BA浓度为3.0 和4.0 mg/L时，诱导出的愈伤组织相对较多，丛生芽量少且细弱。同时初培养诱导结果显示，球茎嫩芽作为外植体，可以通过器官直接发生途径诱导产生丛生不定芽，其最适诱导培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

2.2不同6-BA浓度对丛生芽继代增殖的影响

由表2可知，6-BA浓度为2.0 mg/L时，‘火焰品种不定芽的平均增殖面积和增殖倍数分别为4.6 cm2和8.2，效果最佳，与其他处理存在显著差异；在4.0 mg/L 6-BA处理下的增殖效果最差。另外，大于1 cm植株数在該组试验中都较少，在低浓度1.0 mg/L时平均分化出1.0株。综合考察可知，不定芽增殖的最适培养基均为1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.2 mg/L。

2.3不同6-BA浓度对不定芽植株再生的影响

光照培养45 d后，不定芽分化率达100%。由表3可知，6-BA浓度为0.2和0.8 mg/L的处理，不定芽块生长较好，增殖面积都超过4.0 cm2，且6-BA浓度为0.8 mg/L时，增殖倍数为6.4。6-BA浓度为0.2 mg/L时，大于1 cm植株数为6.3株，与其他处理具有显著差异。由此可知，火焰不定芽植株再生的最适培养基为1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

2.4不同活性炭浓度对再生植株生根和株高的影响

由图1可知，不同活性炭浓度对再生植株生根的影响存在显著差异。未添加活性炭的对照中，植株根数较多，但都未超过1 cm，且植株高度在所有处理中最矮；随活性炭浓度增高（0～4.0 g/L），植株生根数先增加后减少。活性炭浓度为2.0 g/L时，平均每株生根数达2.5条，明显优于其他处理，此时植株根系长且发达，有许多侧根长出，平均每株植株高度为6.9 cm。综合各指标结果表明，活性炭对‘火焰生根具有显著促进作用，最适浓度为2.0 g/L。

2.5试管苗的炼苗及移栽

将生根试管苗不开瓶盖炼苗3 d，打开瓶盖后炼苗2 d。取出试管苗，在清水中洗涤2次，小心洗去根部的培养基，尽量不要损伤根部。栽到播种土和珍珠岩以3∶1混合的基质中，用水浇透，置于苗床上，并搭塑料小拱棚，保湿处理2 d，成活率可达98%。

3讨论

3.1外植体的选择及初培养丛生芽诱导

该试验是以球茎嫩芽作为外植体，通过不定芽发生途径来建立离体快繁体系。郑柱[13]也是以切割直径为0.4～0.6 cm的嫩芽块作为外植体，认为添加NAA 0.1 mg/L、6-BA 2.0 mg/L至MS培养基中诱导效果最好；赵润洲等[14]也是通过不定芽途径建立彩色马蹄莲离体快繁体系，得出最佳不定芽诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。也有很多学者以叶片作为外植体，采用愈伤组织间接发生途径，如龚雪琴等[15]选用叶片作为外植体，认为在MS 培养基中添加6-BA 和2，4-D 对愈伤诱导率有显著影响，6-BA和2，4-D 影响胚性愈伤组织的诱导，不同激素的配比也是关键因素；刘金朗[16]对2种彩色马蹄莲品种的幼嫩叶片进行了初代诱导研究，认为在MS+ KT 5.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L的培养基中，30～40 d即可产生愈伤组织。

2种方式都可以建立植物的离体快繁体系，以叶片作为外植体是通过脱分化形成愈伤组织，再分化出不定芽，然后进行继代增殖，生根培养，最终形成再生植株。相对而言，这一过程比较漫长且容易引起变异，使再生植株失去原有的优良性状。而通过诱导不定芽建立其离体快繁体系，能够缩短时间，节省成本，且有利于优良性状的保持[2]。通过何种方式建立快繁体系也与植物品种及外植體的选择有较大关系。

3.2品种增殖及植株再生的激素及浓度

彩色马蹄莲组培过程中，激素浓度和种类是影响其快繁增殖及分化的主要因素 [17-19]。该研究显示，6-BA浓度是影响丛生芽增殖的关键因素，试验通过6-BA与NAA配合使用来促进不定芽的增殖，结果表明1.0～4.0 mg/L 6-BA均可实现增殖，但明显表现为低浓度下促进不定芽再生植株的生长，而高浓度有利于不定芽的大量增殖。这与郑柱[13]、王进忠等[20]的观点一致。前者认为在添加1.5～2.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA時，能显著促进黄花马蹄莲丛生芽的大量增殖，而后者认为高浓度6-BA 有利于愈伤组织和芽的分化，低浓度则对芽的生长有利。另外选择生长素0.2 mg/L NAA与细胞分裂素6-BA相互配合来促进植株再生，这与王伟英等[12]、张丽等[10]的研究观点是一致的。也有研究者采用6-BA与其他的激素配合来促进不定芽增殖及分化。何俊蓉等[21]认为，丛芽增殖的培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+TDZ 2.0 mg/L，再将其转接到低浓度的NAA 上以促进不定芽分化成苗；龚雪琴等[15]认为，继代和愈伤组织继续发生的最佳培养基为MS+2，4-D 2.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L。研究结果不尽相同，可能与研究品种不同及离体快繁体系各环节预设条件不同都有一定的关系。

45卷16期张 慧等‘火焰品种彩色马蹄莲组培快繁体系的建立及优化

3.3再生植株生根该试验添加2.0 g/L活性炭促进再生植株生根，这与赵润洲等[14]、李开云等[22]的研究观点是一致的，只是活性炭的添加量存在差异。赵润洲等[14]认为，最佳生根培养基为1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭0.5 mg/L；李开云等[22]认为，MS+NAA 0.5 mg/L+0.2%活性炭效果最好。该试验选取NAA作为促进生根的外源激素，也有很多研究采用IBA作为外源激素，如张军云等[23]认为添加IBA 0.3 mg/L对生根的诱导效果最佳；孙新政等[24]用6-BA配合0.2 mg/L IBA促进红色马蹄莲生根；邵果园等[17]用0.2 mg/L IBA促进黄色马蹄莲生根，促进生根所选用激素不同可能与品种不同有较大的关系。应用何种激素更加经济实惠也是产业化生产需要考虑的问题。

4结论

该试验建立并优化了‘火焰品种彩色马蹄莲的离体快繁无性繁殖体系，结果表明，以球茎嫩芽作为外植体，最佳诱导培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，丛生芽诱导率可达29.6%，此时丛生芽量多，生长健壮；最佳增殖配方为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，增殖倍数最大为8.2；植株再生最适合培养基为 1/2MS+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；最适生根培养基为1/2MS+0.2 mg/L NAA+2.0 g/L活性炭。

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