茉莉酸甲酯对藜感染黄瓜花叶病毒后的生理影响

夏明星 于晓云 陈伟

摘要 [目的]探究茉莉酸甲酯（MeJA）对黄瓜花叶病毒介导藜的抗病生理反应的影响。[方法]采用MeJA及其抑制剂没食子酸丙酯（PG）预处理藜叶片后，分别接种黄瓜花叶病毒（CMV），并于接种0、1、3、5、7、9 d后测定其叶中H2O2质量分数、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性等生理指标的变化。[结果]与对照相比，MeJA处理的接种藜叶POD活性前期降低，中后期逐渐升高，CAT、SOD活力与POD相反。接种CMV后，MeJA能提高相关抗氧化物酶的活性，其抑制剂PG处理后对MeJA所调控的氧化酶活性具有一定的抑制作用。[结论]MeJA对藜抗CMV有一定的促进作用。

关键词 茉莉酸甲酯；没食子酸丙酯；藜；CMV病毒

中图分类号 S432.2+2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0154-04

Abstract [Objective]The aim was to find out the effect of Methyl jasmonate （MeJA） on Cucumber mosaic virus （CMV）mediated physiological responses in Chenopodium album.[Method]The leaves of Chenopodium album were pretreated with either MeJA or its inhibitor gallic acid propyl gallate （PG）， and then were infected by CMV for 0， 1， 3， 5， 7 and 9 d. After collecting the leaves samples， the contents of H2O2 content and activities of the antioxidant enzymes including CAT， SOD and POD activity were determined.[Result]Compared to controls， POD activity was suppressed by MeJA pretreatment at the beginning， and went up gradually afterwards，while CAT and SOD activity in contrast to the POD. Furthermore， after inoculation with CMV， activities of the antioxidant enzymes pretreated with MeJA were significantly enhanced， whereas they were suppressed as pretreated with the inhibitor PG. [Conclusion]MeJA plays positive role in physiological resistance of Chenopodium album against CMV.

Key words Methyl jasmonate；Propyl gallate；Chenopodium album；Cucumber mosaic virus

黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，简称CMV）是世界上流行的植物病毒之一，其侵染寄主广泛，因而也是目前研究较多的具经济重要性的植物病毒之一，其发生程度与蚜虫繁殖情况密切相关。目前生产上大多通过防治蚜虫来达到防治CMV的目的，而现有的防蚜虫方式主要为化学防治，化学药剂在长期的使用过程中其“3R”问题越来越被人重视。为解决上述问题，植物诱导抗病性被提了出来，Kloepper将诱导抗病性定义为“由生物或非生物因子激活的、依赖于寄主植物的物理或化学屏障的活化抗性过程”[1-2]。研究表明，茉莉酸（JA）及其衍生物、乙烯（ETH）、水杨酸（SA）等能有效诱发植物系统获得性抗性（SAR）[3]。茉莉酸甲酯（MeJA）是高等植物体内的内源生长调节物质，对植物生长发育具有极为重要的生理作用[4]。MeJA易挥发，可从植物的气孔进入植物体内，于细胞质中被酯酶水解为茉莉酸，实现长距离信号传导和植物间的交流，致使邻近植物产生诱导防御反应[5]。目前已有大量研究表明，外源施用MeJA可诱导植物防卫基因的表达、相关防御酶活性增强及多种次生代谢物质的合成等，并能增强植物对病原菌的抗性[6-7]。没食子酸丙酯（PG）是一种来源于绿色植物的天然多酚类化合物，也是一种极为重要的没食子酸衍生物[8]。研究表明，亚麻酸通过脂氧合酶（LOX）、丙二烯氧化物合成酶（AOS）等一系列酶促反应生成JA与MeJA[9]，而PG是LOX脂氧合酶的抑制剂，通过抑制LOX活性而有效抑制JA合成途径[10]。

笔者以植物病毒的指示植物——藜为材料，研究了MeJA及其抑制剂PG对藜感染黄瓜花叶病毒后生理反应的影响，以期探究茉莉酸甲酯与CMV病毒及藜抗病毒机制间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

藜（Chenopodium album）从四川农业大学成都校区校园田间移栽获得，所选材料均为高约30 cm、大小均匀、长势一致的植株。黄瓜花叶病毒由四川农业大学农学院植物病理实验室提供。

1.2 试验前处理

以200 μmol/L MeJA与1 mmol/L PG溶液分别喷施整株，以喷施蒸馏水的处理为对照，之后放于透明密闭的装置中培养。培养24 h后，以2种方式处理植株叶片，第1种方式是采用摩擦接种方式接种CMV病毒，每株接种4～7片叶；第2种是仅摩擦叶片但不接种CMV病毒，每株处理4～7片叶作为模拟接种对照，设3次重复。接种后，每天观察植株的发病情况，直至发病叶片脱落为止，并做详细记录。

1.3 生理指标的测定

分别于接种后0、1、3、5、7、9 d摘取经上述处理叶片测定以下几个指标：过氧化氢（H2O2）含量、过氧化氢酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性。按Velikova等[11]的方法测定H2O2含量，参照结合Beers等[12]和Patra等[13]方法测定CAT活性，用NBT光还原法测定SOD活性，采用愈创木酚法测定POD活性。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2007对试验进行分析，应用SPSS 17.0进行差异显著性和相关性分析。对不同溶剂处理下藜的各项生理指标进行单因素方差分析，结果用“平均数±标准误差”表示，单因素方差分析后做多重比较。

2 结果与分析

2.1 藜接种CMV后的表型变化

接种5 d后，经MeJA处理的接种叶开始变黄且有芝麻粒大小的枯斑出现，而经PG和蒸馏水处理的接种叶7 d后才表现出相同症状；经MeJA、PG、蒸馏水处理的接种叶片出现花叶的时间依次为10、8、9 d，叶片经PG处理出现花叶的时间较蒸馏水处理的时间提前，而MeJA处理后藜叶片出现花叶的时间比蒸馏水处理延后。

经MeJA溶液、PG溶液和蒸餾水处理的植株出现枯斑的时间存在一定差异，其原因可能是因为受CMV侵染后，植物细胞快速死亡，植株产生了超敏反应，MeJA能够促进超敏反应，所以出现枯斑的时间比其他2种处理更快，由于MeJA处理产生的超敏反应更早，导致病原菌扩展变慢，植株发病时间推迟，而PG抑制了JA途径，导致植株发病时间提前。

2.2 MeJA对藜几个生理指标的影响

2.2.1 喷施MeJA后藜接种CMV叶中H2O2质量分数及CAT活性变化。

从图1可以看出，经MeJA处理后模拟接种的叶片和蒸馏水处理的接种叶片CAT活性变化基本一致，总体呈现先升高后降低的变化趋势；而经MeJA处理的叶片CAT活性较其他2组处理提前到1 d达到最大值，其可能的原因是：外源喷施的MeJA可诱导植株体内相关细胞或组织启动防御机制，因此可以对病原菌的侵染较蒸馏水、PG处理叶片提前做出应答。

从图2可以看出，经MeJA处理后接种的叶片体内H2O2呈现先上升后下降的变化趋势，并在整个检测过程中出现了2次峰值，而经过蒸馏水处理后接种CMV和MeJA处理后模拟接种的2组处理的H2O2变化情况基本一致，只在接种后第9天有差异。

经MeJA处理接种的叶片CAT活性在0～1 d升高，1～3 d降低，而H2O2 质量分数在0～3 d逐渐升高，可能是因为MeJA的处理导致了植物体内本身积累了一定量的H2O2，虽然CAT活性在接种后1～3 d降低，但其降低速度低于之前升高速度，故植物体内H2O2质量分数在接种后1～3 d在缓慢增加。3种处理的H2O2都是先增加到顶峰，随后逐渐降低，MeJA处理的接种叶较蒸馏水处理的接种叶和MeJA处理模拟接种叶先达到峰值，这可能是因为经MeJA处理后接种CMV的藜叶片内CAT活性较其他2个处理先降低到最低值；而后期在CAT活性基本不变的情况下H2O2的质量分数逐渐增加，其可能的原因是MeJA启动的衰老程序中产生了较多的H2O2，这可能与藜较早产生超敏反应有关。

2.2.2 喷施MeJA后藜接种CMV叶中SOD活性的变化情况。经研究，SOD是生物体内清除自由基的首要物质，可对抗与阻断超氧阴离子自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。由图3可知，前期SOD活性增加速度由高到低依次为MeJA处理组、MeJA模拟接种处理组、蒸馏水处理组，这可能是因为MeJA能够快速诱导植物体内产生抗性，以增加SOD活性来修复因病毒侵染而对细胞造成的损害。因为SOD强大的修复功能，植株细胞因侵染和摩擦的损害都在不断的愈合[14]，所以在中期其活性变化不会太大。MeJA模拟接种处理SOD在7 d出现了峰值，很有可能是模拟接种时植物摩擦受伤，从而诱导了内源JA所调控的过程，进而增加自身对机械损伤的抗性。

2.2.3 喷施MeJA后藜接种CMV叶中POD活性的变化情况。

POD不仅参与植物体内木质素的聚合过程，也是细胞内重要的内源活性清除剂，故POD活性与植物抗病性有密切的关系[15]。汤会君等[16]研究表明，烟草接种病毒后抗病品种POD活性升高。由图4可以看出，3个处理POD活性变化趋势相似均呈现先下降后上升又下降的趋势，所不同的是MeJA模拟接种处理组恢复上升最早，于第3天恢复到较高水平，并保持到第5天；MeJA接种处理组次之，于第5天恢复到最大值；蒸馏水处理组则在第7天。可以推测MeJA能促使植株产生对CMV的抗性。

2.3 PG对藜几个生理指标的影响

2.3.1 喷施PG后藜接种CMV葉中H2O2质量分数及CAT活性的变化情况。

在逆境胁迫下，细胞内易产生H2O2破坏膜系统的稳定性，而CAT能把H2O2分解，从而清除H2O2维护膜的稳定性，就抗逆性强的品种来说过氧化氢酶活性与抗逆性呈显著性相关。由图5、6可知，H2O2质量分数变化并没有同其相应CAT的变化呈一定的相关性，其可能的原因是影响CAT活性的因素有很多，PG与JA的作用时期也是其中之一，故PG与CAT这2种生理指标不一定有直接联系。在前期经PG处理的H2O2质量分数在缓慢下降，与图2各处理前期的变化相反，很有可能是PG抑制了植物体内MeJA所诱导的超敏反应的产生，从而降低了植物对病毒与受伤的防御反应能力。

2.3.2 喷施PG后藜接种CMV叶中SOD活性的变化情况。

由图7可以看出，经PG处理的接种叶片SOD活性与PG处理的模拟接种叶片SOD活性变化趋势恰恰相反，这很有可能是因为在接种CMV后，0～1 d时经PG处理的植株被病毒侵染激发体内防御机制，使能够修复损害细胞的SOD活性增强，而PG模拟接种组并未实际接种CMV病毒，所以SOD活性未增加；在接种后1～3 d模拟组SOD活性开始增加，可能是因为之前摩擦对植物细胞造成了损伤，致使植物开始自动修复。接种CMV的蒸馏水处理组SOD活性在200 U/g小幅度波动，没有明显变化，可能是采样叶片在接种病毒时摩擦得不够，既未对植物叶片造成伤害，也未能将病毒成功接种于植物体内，故在植株正常生长过程中，SOD活性无太大变化。

2.3.3 喷施PG后藜接种CMV叶中POD活性的变化情况。从图8可以看出，3个处理组POD活性变化趋势基本一致，均呈现出先下降后升高至峰值然后再降低的变化趋势只是出现峰值的时间点不同。其中，PG处理后模拟接种的叶片POD酶活力始终低于初始酶活力，而经PG处理和蒸馏水处理后接种CMV的叶片POD酶活力最大值高于初始酶活力，下降后的回升均出现在第7天。与图4相比，经PG处理的接种CMV叶片的POD活性回升较经MeJA处理的接种CMV叶片推迟2 d，而经PG处理的模拟接种叶片的POD活性则无回升趋势，故推测PG可能抑制了MeJA所调控的POD活性上升过程。研究表明，接种病毒后抗病品种植物的POD会升高，而此处PG抑制了植物产生抗性反应[15]。

3 讨论与结论

研究表明，MeJA不仅能有效调控植物的生长发育，且在植物胁迫防御中也有重要作用[17]，增强植物抵御不良环境的能力[18]。当植株受到外界胁迫时，体内的SOD活性会明显增强，以提高其自身的抗氧化能力和抗病性[15]。禹艳红等[19]研究表明，MeJA能提高巴西烟草对CMV的抗性，且指出SOD活性与抗病毒有较密切的关系。该试验中，经MeJA处理的藜接种叶SOD活性比空白對照组高，而PG处理的藜接种叶SOD活性在0～1 d升高，1～3 d降低，但总体低于MeJA处理组，表明MeJA能有效提高植株藜体内的SOD活性。

POD不仅是木质素合成的关键酶之一，而且还参与氧自由基的消除反应和乙烯生物合成，同植物的抗病性密切相关[20]。该试验中，MeJA处理的接种藜叶POD活性前期降低直到低于对照，中后期逐渐升高，且高于对照，这与师金鸽等[21]的试验结果相同。

H2O2作为植物对外界环境胁迫反应的调节因子，除了能直接杀死病原物外，还可选择性诱导许多相关基因的表达，以提高其自身免疫能力。该研究表明，经MeJA处理的藜接种叶在接种后0～3 d其CAT活性先升高后降低，而相对应的H2O2质量分数也随之升高，这同师金鸽等[17]的试验结果相符。经PG处理的接种藜叶0～3 d先升高后降低，其相对应H2O2质量分数则一直在降低。何强等[8]研究表明，PG作为MeJA的抑制剂，能与蛋白质结合抑制某些氧化酶的活性，所以PG可能是抑制了植物体内MeJA的形成，导致H2O2质量分数降低，从而抑制植株的抗病性。

综上所述，藜接种CMV后MeJA能提高相关氧化酶的活性，其抑制剂PG处理后对MeJA所调控的氧化酶活性变化过程则有一定的抑制作用，故MeJA对藜抗CMV有一定的促进作用。

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