西藏山羊DQA2基因多态性与血液免疫性状的相关性分析

吕雪峰 李亚东 何茜

摘要 [目的]了解西藏山羊DQA2基因与血液免疫性状的关系。[方法]利用PCR-RFLP对西藏山羊DQA2基因外显子2多态性及其血液免疫指标效应进行了分析。[结果]在西藏山羊中共检测到4种基因型，由3个等位基因控制。其中，BB基因型淋巴细胞数目显著高于AB型和BC型（P<0.05），BB型中间细胞数目高于AB型和BC型，BB型平均血红蛋白含量低于AB型和BC型，但均差异不显著。[结论]西藏山羊BB基因型是影响血液淋巴细胞总数的重要因素，与血液免疫指标有一定的相关性，可作为抗病育种的遗传标记，也为后期的辅助选择提供了科学依据。

关键词 西藏山羊；MHC-DQA2；血液免疫；多态性

中图分类号 S827 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0107-03

Abstract [Objective] To understand the relationship between DQA2 gene and blood immune traits in Tibet goat.[Method]The polymorphism of exon 2 of DQA2 gene of Tibetan goat and the effects on blood immune traits were studied by PCRRFLP.[Result]Four genotypes were detected in Tibetan goat，which were controlled by three alleles.Lymphocyte count（WSCC）with genotype BB was significantly higher than that with genotype AB and BC （P<0.05）.Intermediate cell count （MID） with genotype BB was higher than that with genotype AB and BC.Mean corpuscular hemoglobin（MCH） with genotype BB was lower than that with genotype AB and BC，but there was no significant difference.[Conclusion]Genotype BB was an important factor affecting WSCC.There was correlation between genotypes and blood immune traits，so it could be used as a genetic marker for disease resistance breeding，and it also provided scientific basis for the latter selective breeding.

Key words Tibetan goats；MHCDQA2；Blood immune；Polymorphism

西藏山羊是我國非常重要的畜禽资源，也是国家重点保护的品种之一，主要产地在西藏、四川、甘肃部分地区[1]。西藏山羊所产的羊绒平均细度14 μm，長度40～50 mm，属于羊绒中的精品。该品种具有耐粗饲、耐高寒、抗缺氧、抗病力强、适应性好等特点[2]。

主要组织相容性复合体（Major histocompability complex，MHC）是由紧密连锁、高度多态的基因座组成的复合体，由 Ⅰ 类、Ⅱ 类和 Ⅲ 类基因组成，存在丰富的多态性。其中，Ⅱ 类基因的多态性在动物免疫中发挥最主要的作用，Ⅱ 类基因包含DQ、DR、DO等亚区，其产物参与抗原递呈和 T 细胞激活，在机体免疫系统中起着非常重要的作用，是开展抗病育种的首选标记基因。山羊的MHC也称为山羊白细胞抗原（Goat lymphocyte antigen，GOLA）。对山羊GOLA基因遗传多态性的研究，主要集中在 DR 亚区的 DRB 基因[3-5]和DQ亚区的DQA1基因[6-8]，有关山羊DQA2基因的研究报道较少。目前，已经发现 DQA2 基因在藏绵羊中具有丰富的遗传多态性[9-10]。Zhou等[11]发现山羊的 DQA2基因也具有丰富的多态性。邢凤[12]发现山羊 DQA2 与线虫抗性有一定的相关性，并发现 DQB1 基因与血液免疫指标也有一定的相关性[13]。李俊营等[7]应用 PCR-RFLP技术检测了山羊 DQA2 基因遗传多态性，在 HaeⅢ 酶切位点上检测到由3个等位基因控制的5种基因型。

西藏山羊长期生活在高海拔地区，具有优良的抗逆性，因此了解西藏山羊DQA2的遗传多样性和免疫系统的关系是研究其抗病性能、开展抗病育种的基础。笔者利用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）对西藏山羊DQA2基因外显子2进行遗传多态性分析，并结合DQA2基因与血液免疫性状的相关性进行了研究，探讨DQA2 基因与西藏山羊血液免疫性状的相关性，旨在筛选出具有显著效应的分子遗传标记，为西藏山羊辅助性选择、抗病育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 西藏山羊（白绒型）99只和西藏山羊（紫绒型）56只，分别采自西藏阿里地区日土县和措勤县，颈静脉采血，EDTA抗凝，冷藏保存。

1.2 引物合成与PCR扩增

1.2.1 引物设计与合成。DQA2引物序列为：5′-CTTCCTGCTCCTCACCCTCAC-3′和5′-AAAGAGAAGTAGAATGGTGGACACTT -3′[13]，扩增片段长度约304 bp，引物由上海生工股份有限公司合成。

1.2.2 PCR扩增。PCR反应体系（25 μL）：基因组DNA 1 μL（约100 ng）、10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL、Taq酶 0.5 μL、ddH2O 17 μL。PCR反应程序如下： 94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 32个循环； 72 ℃延伸5 min，4 ℃下保存。将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 RFLP 检测与测序 采用限制性核酸内切酶HaeⅢ对PCR产物进行酶切，酶切反应体系为 20 μL，包括 PCR 产物 10 μL、限制性内切酶 HaeⅢ 0.5 μL、10 × NE buffer 2 μL、ddH2O 7.5 μL ，37 ℃恒温条件下酶切 15 min，将酶切产物进行3.0%琼脂糖凝胶电泳检测。根据酶切结果，将纯合基因型个体PCR产物送交上海生工股份有限公司测序。

1.4 血液免疫指标测定 使用全自动动物血细胞分析仪（型号XF6030），测定西藏山羊的血液免疫指标，包括白细胞数目（WBC）、淋巴细胞数目（W-SCC）、中间细胞数目（MID）、中性粒细胞数目（W-LCC）、血红蛋白浓度（HGB）、 红细胞数目（RBC）、红细胞壓积（HCT）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）、红细胞分布宽度变异系数（RDW-CV）和红细胞分布宽度标准差（RDW-SD）。

1.5 数据处理 血液免疫指标数据使用Excel软件计算，结果均以平均值±标准差表示；等位基因频率、观察杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）均采用PopGene 1.32（FrancisC.Yeh，Ph.D）软件进行计算；多态信息含量（Polymorphism information content，PIC）使用PIC_Calc 0.6软件进行计算。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果 对西藏地区白绒型、紫绒型山羊DQA2基因外显子2进行PCR扩增，得到一条约304 bp的特异性条带，经过测序分析可知，该PCR片段与预期的目的片段相一致。

2.2 PCR-RFLP检测 对PCR 扩增产物进行 HaeⅢ 酶切后出现4种结果（图1），4种基因型分别命名为AB、BB、BC、AC，由3个等位基因控制。酶切结果表明，西藏山羊白绒型和紫绒型DQA2基因第2外显子存在3个多态性酶切位点。

从图2可以看出，该段的DNA序列存在1个HaeⅢ多态性位点，位于82 bp处。这说明基因型BB的测序结果与酶切结果相一致。

2.3 DQA2基因外显子2的多态性分析 由表1可知，在西藏山羊中共检测到4种基因型，这4种基因型在西藏山羊白绒型和紫绒型群体中的分布基本均衡。无论白绒型还是紫绒

型，AB基因型频率最高，BB基因型频率次之，BC和AC基因型频率较低；在白绒型山羊中只检测到BC基因型，在紫绒型山羊中只检测到AC基因型。在 2个山羊品系中，等位基因 B为优势等位基因。

从表2可以看出，西藏山羊白绒型和紫绒型的观察杂合度（Ho）分别为0.656 6和0.535 7， 期望杂合度（He）分别为0.455 8和0.421 5，2个群体的观察杂合度都高于期望杂合度；2个群体的多态信息含量分布为0.367 4和0.344 2，较为接近。

2.4 DQA2基因多态性与免疫性状的相关性 从表3可以看出，紫绒型西藏山羊白细胞数目（WBC）、淋巴细胞数目（W-SCC）、中间细胞数目（MID）都显著高于白绒型西藏山羊（P<0.05）。DQA2基因不同基因型与免疫指标的相关性分析表明，在西藏白绒型山羊中，BB基因型淋巴细胞数目显著高于AB型和BC型（P<0.05），BB基因型中间细胞数目高于AB型和BC型，

BB基因型平均血红蛋白含量低于AB型和BC型，但差异均不显著；在紫绒型西藏山羊中，BB基因型淋巴细胞数目显著高于AB型和BC型（P<0.05）。

3 讨论

西藏山羊是藏族牧民长期饲养和选择而形成的多用型（绒、毛、肉、奶、皮）普通品种，也是高原、高寒地区的一个古老地方品种，根据毛色分为白绒型和紫绒型。西藏山羊具有耐粗饲、耐高寒、抗缺氧、抗病力强、适应性好等特点，深受藏族牧民的喜爱。

在抗病育种领域，MHC由于自身的特点，常被育种学家作为首选标记基因，其基因序列发生变异可能影响宿主对病原体的免疫应答，也可能导致物种间抗病性和疾病易感性发生变异，如 MHC 与山羊流产[14]、绵羊布鲁氏菌病[15]、包虫病[16]的易感性相关。该研究对西藏山羊DQA2 基因外显子2进行了RFLP 检测，在限制酶HaeⅢ酶切位点上共检测到4种基因型，与莱芜黑山羊、波尔山羊和鲁波山羊DQA2的检测结果相似。其中，BC基因型仅在西藏白绒型山羊中检测到，仅检测到4个个体；AC基因型仅在西藏紫绒型山羊中检测到，只检测到2个个体，其原因一方面可能与样本数量有关，另一方面也是因为BC、AC这2个基因型在西藏山羊2個品系中分布较少，这可能是自然或人工选择的结果。西藏山羊在育种历史过程中，未经过引入杂交，其血统较为原始纯正，受选择的机率很大。

遗传多样性是物种生存适应环境的基础，也是物种进化的前提。物种遗传多样性越高，遗传变异性越丰富，物种对环境变化的适应能力也就越强。可用期望杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）和多态信息含量（PIC）值的高低来反映群体内遗传变异的大小。西藏山羊白绒型和紫绒型的观察杂合度（Ho）分别为0.656 6和0.535 7，期望杂合度（He）分别为0.455 8和0.421 5，西藏山羊2个群体的观察杂合度均高于期望杂合度，说明西藏山羊2个群体中杂合子含量较多，遗传多样性比较丰富。根据Botstein 等[17]提出的多态信息含量（PIC），PIC>0.5 为高度多态，0.25< PIC<0.5 为中度多态， PIC<0.25 为低度多态。西藏山羊的多态信息含量为0.367 4和0.344 2，可判断为中度多态，从多态信息含量来看可认为西藏山羊具有较丰富的遗传多样性。

血液免疫指标对动物机体生理状况和代谢水平具有客观的指示作用。虽然血液免疫指标受到不同因素的影响，如年龄、性别、生理状态、营养水平等，但因其具有相对的稳定性，所以这些指标的相应变化可以反映动物机体的生理与病理的变化。在动物机体防御机制中，白细胞是重要的组成部分，淋巴细胞是白细胞的一种，按其发生和功能的差异分为T淋巴细胞和B淋巴细胞，是种羊的免疫活性细胞，针对某一抗原起特异性反应；中性粒细胞作为机体抵御病原体入侵的第一道防线，具有很强的吞噬能力，能将大部分病原体吞噬消化。无论是白绒型西藏山羊还是紫绒型西藏山羊，BB基因型的淋巴细胞数目均显著高于AB、AC和BC 3种基因型，表明西藏山羊DQA2基因外显子2与淋巴细胞数目显著相关；另外，BB基因型的中性粒细胞数目和中间细胞数目也高于AB、AC和BC基因型，但未达到显著水平。这说明BB基因型是影响西藏山羊血液免疫指标的因素。同时，紫绒型西藏山羊的白细胞数目、中间细胞数目、淋巴细胞数目与中性粒细胞数目均高于白绒型西藏山羊，说明紫绒型西藏山羊在血液免疫方面强于白绒型山羊，同时也反映了该品种的特异性。

该研究发现西藏山羊DQA2基因与血液免疫性状存在一定的相关性，但受限于样本数量，使得BC、AC基因型的樣本数量过少，在后期的研究中应加大样本数量，发现更多的与免疫性状有关的DNA分子标记，为绒山羊抗病育种提供更可靠的参考价值。

4 结论

在西藏山羊中共检测到4种基因型，基因型频率由高到低依次为AB、BB、BC 和AC，白绒型山羊中只检测到BC基因型，紫绒型山羊中只检测到AC基因型。在2个品系中，等位基因B为优势等位基因。白绒型山羊和紫绒型山羊2个品系的多态信息含量分别为0.367 4和0.344 2，属于中度多态性。BB基因型淋巴细胞数目显著高于AB型和BC型，可认为是影响西藏山羊血液免疫指标的主要因素。紫绒型西藏山羊的白细胞数目、淋巴细胞数目、中间细胞数目都显著高于白绒型西藏山羊。

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