响应面法优化猪血浆蛋白制备铁螯合肽的酶解工艺

殷俊峰 张福生 朱峰 郭俊 范翠玲 朱梅

摘要[目的]优化响应面法对猪血浆蛋白酶解制备铁螯合多肽的工艺。[方法]应用响应面法对猪血浆蛋白酶解制备铁螯合多肽的工艺进行优化，在单因素试验的基础上，选择pH、水解温度、水解时间为影响因素，以水解度为指标，进行3因素3水平的Box-Behnken 中心组合试验设计，采用响应面法分析3个因素对响应值的影响。[结果] 响应面法优化猪血浆蛋白制备蛋白粉的最佳工艺条件为 pH 77，温度46.3 ℃，水解时间7.4 h；在此条件下，蛋白的水解度为35.52%，水解物螯合率为79.41%。[结论]该工艺可为猪血浆蛋白开发利用提供新的思路。

关键词响应面法；猪血蛋白；水解；水解度

中图分类号S879文献标识码A文章编号0517-6611（2017）23-0084-05

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process for Preparation of FeChelating Peptides from Porcine Plasma Proteins by Response Surface Methodology

YIN Junfeng1，ZHANG Fusheng1，ZHU Feng2 et al

（1. Institute of Agricultural Products Processing， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031；2.Anhui Mount Everest Biotechnology Co.， Ltd.， Taihe， Anhui 236600）

Abstract[Objective] To optimize the preparation of iron chelate polypeptide by hydrolysis of porcine plasma protein by response surface methodology. [Method] Response surface methodology was used to optimize the preparation of iron chelate polypeptide from porcine plasma protein hydrolysates，on the basis of single factor test， pH， hydrolysis temperature and hydrolysis time were selected as influencing factors， and hydrolysis degree as index，the BoxBehnken central composite experimental design of 3 factors and 3 levels， used the response surface method to analyze the influence of 3 factors on the response value.[Result]In response to the optimized process of preparation of protein powder surface method for preparation of porcine plasma protein pH 7.7， hydrolysis temperature 46.3 ℃， hydrolysis time 7.4 h， under this condition， hydrolysis degree of protein hydrolysate was 35.52%， chelation rate was 79.41%. [Conclusion] This process can provide new ideas for the development and utilization of pig plasma proteins.

Key wordsResponse surface analysis；Porcine serum protein；Hydrolysate；Degree of hydrolysate

作者簡介殷俊峰（1969—），男，安徽凤阳人，副研究员，从事农产品贮运保鲜及加工研究。

收稿日期2017-07-19

猪血是生猪屠宰后的一种副产品，每100 g猪血中含蛋白质16 g，高于牛肉、瘦猪肉蛋白质的含量，而且容易消化吸收，猪血蛋白质所含的氨基酸比例与人体中氨基酸的比例接近，富含铁元素，胆固醇比猪肉还低，非常容易被机体利用。猪血血浆中粗蛋白含量超过75%，粗脂肪2%，消化能和代谢能非常高，能满足动物幼崽时期的营养需求，赖氨酸含量高于其他动物源饲料，氨基酸比例平衡，适口性好，蛋白质消化率在 95%以上[1]，富含具有生物学特性的蛋白如IgG 、IgM等[2-3]。

铁是人体必需的微量元素之一。缺铁性贫血是指体内与血红蛋白结合的微量元素铁不足所引发的一种细胞性贫血，目前服用补铁剂是治疗缺铁性贫血最有效的途径之一。氨基酸类补铁剂具有抗干扰性好、稳定性强和易吸收等优点，但它存在着产品单一、价格高和专一性太强的缺点。氨基酸螯合物种类繁多，诸如天门冬氨酸亚铁、赖氨酸亚铁等一系列氨基酸亚铁螯合物。姚磊等[4]通过硫酸亚铁与L-甘氨酸发生螯合反应，最终得到甘氨酸亚铁的螯合率达到65.43%；张晓鸣等[5]研究发现，丙酮等有机溶剂可以有效分离提纯水溶性氨基酸配合物；汪芳安等[6]通过控制反应条件，使得氯化亚铁与L-蛋氨酸发生螯合反应，所得蛋氨酸亚铁产品最终得率为66.80%；秦卫东等[7]通过酶解脱脂豆粕，所得到的氨基酸液與亚铁螯合生成复合氨基酸亚铁。

该研究是以猪血清蛋白作为原料，以碱性蛋白酶水解猪血浆蛋白，通过单因素试验对水解温度、水解pH、底物质量浓度、加酶量和水解时间等工艺参数进行研究，并用响应面法优化制备铁螯合多肽的最佳工艺参数，以期为猪血蛋白资源的开发利用提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料与主要试剂。新鲜猪血，黄山市鑫黄山特产有限公司；盐酸、氢氧化钠（分析纯）、碱性蛋白酶，合肥博美生物科技有限公司。

1.1.2

主要仪器设备。 722型分光光度计，上海普元仪器仪表有限公司；HH-6数显恒温水浴锅、78-I型磁力搅拌器，江苏省金坛荣华仪器制造有限公司；RJ-TDL-5A低速台式大容量离心机，无锡瑞江机械设备有限公司；1000C电子天平，上海凯士电子有限公司。

1.2方法

1.2.1工艺流程。

猪血→离心分离→血浆液→超滤→喷雾干燥→血浆粉→酶解。

1.2.2血浆蛋白粉酶解工艺。

称取一定量的血浆粉，加入适量去离子水，放入气浴恒温振荡器振荡溶解，将溶液pH调至反应所需的pH，加入一定比例的碱性蛋白酶，放入恒温水浴锅，控制温度与时间。反应结束后，100 ℃水浴3～5 min，灭酶。对血浆酶解液进行离心（6 000 r/min，-4 ℃，15 min），上清液滤纸过滤，冷冻干燥，采用TNBS法测定蛋白质水解度。

1.2.3基础理化检测。

对猪血和血浆蛋白粉中的水分、蛋白质等营养物质的含量进行测定。

水分含量按照GB 5009.3—2010的方法进行测定；

蛋白质含量采用凯氏定氮法测定；

脂肪含量采用索氏抽提法测定；

蛋白质水解度的测定采用TNBS法测定；

铁元素含量采用火焰原子吸收法测定。

1.2.4氨基酸组成分析。

称取样品0.1 g于水解管中，加入6 mol/L的盐酸溶液10 mL后，充入氮气，待水解管中的空气排净后拧紧管盖，防止漏气。将充入氮气的旋接管放入110 ℃的烘箱反应22 h后取出冷却，用超纯水定容到50 mL的容量瓶中并混匀，取1 mL于烧杯中，将液体样品真空干燥24 h，加入3 mL的0.2 mol/L的色谱纯HCl溶液，充分混匀后取1 mL液体过0.22 μm滤膜，经氨基酸自动分析仪检测其氨基酸组分。

1.2.5螯合活性测定。

参照GB/T 13885的方法进行测定。

1.2.6单因素试验。

选择水解温度、pH、水解时间、酶添加量、底物浓度作为主要单因素，考察各单因素对酶解蛋白的影响。每组试验重复3次。

1.2.7响应面试验因素及水平。

根据Box-Behnken 中心组合试验设计方案，综合单因素试验结果，选择单因素试验中显著因素（pH、水解温度和时间）进行优化，因素水平设计见表1。

1.2.8数据处理。

每次试验重复3次，取平均值。采用Design-Expert 8.0.5软件进行响应曲面的分析和作图。

2结果与分析

2.1理化性质

猪血血浆蛋白粉的理化指标如表2所示。血浆蛋白是猪血中的主要成分，猪血中蛋白质含量达到4.30%，猪血血浆蛋白粉中蛋白质含量为79.10%，所以猪血是血浆蛋白粉加工的主要原材料。

2.2氨基酸组成

猪血加工副产物氨基酸组成分析如表3所示。猪血中富含氨基酸，氨基酸种类为16 种，其中必需氨基酸有7 种，必需氨基酸总量为43.36%，其中亮氨酸含量最高，为13.74%；赖氨酸次之，为9.06%。猪血血浆蛋白粉中必需氨基酸/氨基酸总量为40.80%，其中亮氨酸含量最高，为9.78%；赖氨酸次之，为8.70%。

2.3单因素试验

2.3.1不同酶解温度对血浆蛋白粉水解度的影响。

底物浓度为6%，初始pH为7，蛋白酶添加量为0.4%，分别在30、40、50、60 ℃下水解4 h，测定不同酶解温度下的蛋白水解度，结果如图1所示。

由图1可以看出，温度对蛋白酶解有显著影响，水解度随着温度的升高而逐渐增加，当温度达到50 ℃，水解度最大；大于50 ℃，水解度逐渐减小。这是由于酶解反应随着温度的升高蛋白酶活性逐渐增大，但是温度过高会降低酶的活性。因此反应温度应控制在50 ℃左右。

2.3.2不同pH对血浆蛋白粉水解度的影响。

调节初始 pH分别为5、6、7、8，底物浓度为6%，蛋白酶添加量为0.4%，45 ℃下水解4 h，测定不同初始pH下的蛋白水解度，结果如图2所示。

图2表明，其他条件一定，pH由5提高至7时，水解度随着pH的升高而增加，在pH为7时达到最大，然而当pH继续升高时，水解度又慢慢减小。可能是因为当pH大于7时，酸碱度影响了底物的空间构象[8]，从而影响了酶与底物的结合，故反应pH应控制在7左右。

2.3.3不同酶解时间对血浆蛋白粉水解度的影响。

固定底物浓度为6%、初始pH为7、酶添加量为0.4%、水解温度为45 ℃，分别水解 2、4、6、8、10 h，测定不同酶解时间下的蛋白水解度，结果如图3所示。

图3表明，在2～6 h之内，随着酶解时间的增加，蛋白的水解度快速增大，6 h达到最大，之后酶解速度放慢，水解度緩慢降低。因此反应时间应控制在6 h左右。

2.3.4不同浓度酶添加量对血浆蛋白粉水解度的影响。

固定底物浓度为6%、初始pH为7，分别添加 0.2%、0.4%、06%、08%、1.0%的碱性蛋白酶，45 ℃下水解4 h，测定不同酶添加量對其蛋白水解度的影响，结果如图4所示。

图4表明，当酶添加量在0.2%～0.6%时，蛋白水解度随着酶添加量的增加而增加，在0.6%时达到最大，随后水解度逐渐减小。可能是由于酶本身也是一种蛋白质，也会发生酶解，如果量太大则会干扰酶解物的组成[9-10]。因此，反应酶添加量应控制在0.6%左右。

2.3.5不同底物浓度对血浆蛋白粉水解度的影响。

调节底物浓度分别为4%、6%、8%、10%、12%，初始 pH为7，蛋白酶添加量为0.4%，45 ℃下水解4 h，测定其不同底物浓度下的蛋白水解度，结果如图5所示。

图5表明，蛋白水解度随着底物浓度的增加影响不大，在底物浓度为8%时，水解度相对其他底物浓度时达到最大，因此反应底物浓度应控制在8%左右。

通过上述5个条件的酶解单因素试验可以得出，pH、水解时间和温度的变化对血浆蛋白粉的水解度具有显著影响，而底物浓度和酶添加量的影响不明显。因此，在接下来的响应面试验中只对pH、水解时间和温度这3个因素进行工艺优化，底物浓度和酶添加量将不再作为影响因素进行研究，选择底物浓度为8%、酶添加量为0.2%作为固定试验条件不再变化。

2.4响应面优化试验

根据Design-Expert 8.0.5软件设计的3因素3水平的响应面试验，结果见表4。

采用Design-Expert 8.0.5软件程序对以上的试验数据进行二次多元回归拟合，分析结果得出血浆蛋白粉水解度的回归方程为

Y=-230.772 25+38.531 5A+3.302 25B+10724 25C-0.037 25AB+0.331 25AC-0.053 125BC-2527 25A2-0.027 672B2-0.746 81C2。

为了检验上述方程的有效性，对回归模型进行方差分析，分析结果得出：

F模型=104.54，P模型< 0.000 1**；

FA=302.13，PA< 0.000 1**；

FB=5.58，PB=0.05；

FC=228.80，PC< 0.000 1**；

FAB=195，PAB=0.20；

FAC=6.18，PAC=0.04*；

FBC=15.90，PBC=001*；

FA2=94.69，PA2< 0.000 1**；

FB2=113.53，PB2< 0000 1**；

FC2=132.30，PC2< 0.000 1**；

F失擬=4.35，P失拟=0.09。

方差分析表明，模型的差异是极显著的（P<0.000 1），说明该模型能够解释大部分试验情况的变化，同时失拟差不明显，这进一步说明了该模型的合理性。因此可以用此模型对整个试验结果进行分析和预测。

3个因素对血浆蛋白粉水解作用比较复杂。在上述回归方程的所有一次项中，对于血浆蛋白粉水解作用影响的顺序为A>C>B，其中A、C 2项影响极显著（P<0.000 1），所以pH和时间对血浆蛋白粉水解影响较大；在所有的平方项中A2、B2、C2 3项影响极显著（P<0.000 1）；而交互项的影响就相对较小。因此，各因素对血浆蛋白粉水解作用影响的大小顺序为pH>水解时间>温度。

2.5响应面分析

采用Design-Expert 8.0.5软件，带入试验数据，分别将模型中的pH（A）、温度（B）、时间（C）的其中一个因素固定在0水平不变，得到其余2个因素之间相互作用对于蛋白水解度的影响。通过软件的Model Graph值分别合成3个因素间交互作用影响的响应面图和等高线图（图6～11）。

2.6最佳水解工艺条件的确定及其铁螯合活性

根据Design Expert 8.0.5软件程序得到血浆蛋白粉酶解的最佳工艺条件为pH 7.7，温度46.3 ℃，时间7.4 h；在此条件下，蛋白水解度的预测值为35.52%。

在上述最佳酶解工藝条件下设计3次平行试验，将3次平行试验的数值取平均值，得到血浆蛋白粉酶解时蛋白水解度平均为37.55%，高于预测值0.03%，水解物螯合率为7941%。证明了响应面分析法对于酶解工艺的优化结果准确可靠，有较高实用价值。

3结论

猪血经过高速离心分离，将血浆和血细胞分离，过滤浓

缩、喷雾干燥，得到血浆蛋白粉。在pH、底物浓度、水解温度、酶解浓度、水解温度对蛋白水解的单因素影响试验中得出pH、水解时间和水解温度这3个因素的变化对蛋白水解度具有很明显的影响，加酶量和底物浓度这2个因素对于蛋白水解度的影响不大。通过响应面优化试验得出：各因素对血浆蛋白粉水解作用影响的大小顺序为pH>水解时间>温度。该试验结果表明，猪血浆蛋白制备蛋白粉的最佳工艺条件为 pH 77，温度46.3 ℃，水解时间7.4 h；在此工艺条件下猪血清蛋白有很好的酶解效果。

参考文献

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