鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT—PCR检测方法的建立及应用

谢志勤 谢芝勋 邓显文 谢丽基 范晴 罗思思 黄莉 黄娇玲 张艳芳 王盛 刘加波 庞耀珊 梁亮 冯务玲

摘要：【目的】建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒（NDV）和禽肺炎病毒（APV）的二重RT-PCR，为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持。【方法】根据GenBank已发表NDV的F基因序列（GenBank登录号JX840454）和APV的F基因序列（GeneBank登录号AF187154）分别设计2对特异性引物，应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR，对扩增条件进行优化，并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性。【结果】优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株（LaSota株、F48E9株、I株）及APV/MN-10毒株的目的条带，其大小分别为247和424 bp，而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现。二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA。应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测，结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份，与血清学方法的鉴定结果一致。随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV（GenBank登录号JX840454）的F基因序列一致，同源性达100%；2份APV阳性PCR产物与APV（GenBank登录号AF187154）的F基因序列也完全一致，同源性达100%。【结论】针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点，可用于临床快速鉴别诊断，为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技術支持。

关键词： 鸡新城疫病毒（NDV）；禽肺炎病毒（APV）；二重RT-PCR；检测

中图分类号： S858.31 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）03-0546-06

0 引言

【研究意义】鸡新城疫病毒（Newcaslte disease virus，NDV）和禽肺炎病毒（Avian pneumovirus，APV）是危害养鸡业的两种主要病毒，二者均为副粘病毒科（Paramyxoviridae）成员，其中，NDV隶属于副粘病毒属（Paramyxovirus），而APV隶属于禽偏肺炎病毒属（Avian pneumovira）（Pringle，1998）。NDV全基因长15198 bp，基因组为不分节段的单股负链RNA，共编码6个基因蛋白，依次为核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素—神经氨酸酶（HN）和大蛋白（L）（Huang et al.，2004）。APV全基因长约14000 bp，为负链RNA，基因中有8种编码蛋白，依次为核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、第二基质蛋白（M2）、小疏水蛋白（SH）、糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）（Naylor et al.，2004；胡海霞等，2012）。这两种病毒引起的临床症状很相似，均可引起禽类上呼吸道的症状，因此根据临床症状很难对二者进行鉴别，需通过实验室检测手段进行确诊。【前人研究进展】我国对NDV的研究非常重视，建立了很多检测诊断方法，如传统的病毒分离鉴定（陈安莉等，2012）和血清学方法等，近年又出现了高通量GeXP检测方法（罗思思等，2013）。这些方法为准确检测诊断NDV提供了技术保障，是有效防控鸡新城疫发生的前提。针对APV的诊断国外已开展了相关研究，我国起步相对较晚，其诊断方法主要有病毒分离鉴定（Goyal et al.，2000；Cook and Cavanagh，2002）、ELISA（Gulati et al.，2000；Goyal et al.，2003）、RT-PCR（Shin et al.，2000；陈琳等，2012）、Taqman探针荧光定量PCR（谢志勤等，2014a）等。虽然目前实验室诊断NDV和APV的方法都已成熟，但缺少针对两种病混合感染的快速鉴别诊断，不利于养鸡业的健康发展。二重（或多重）PCR是利用两对（或多对）引物同时扩增两个（或多个）模板，能有效弥补常规PCR的不足（范志宇等，2015；秦毅斌等，2016），在禽类疫病鉴别诊断中得到广泛应用，如吴萍萍等（2010）建立了鸡传染性贫血病毒和禽网状内皮增生症病毒二重PCR检测方法，谢丽基等（2012）建立了鸭I型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒三重RT-PCR检测方法，谢志勤等（2016）建立了H9亚型禽流感病毒和APV二重RT-PCR检测方法，奉彬等（2016）建立了鸡细小病毒和禽呼肠病毒二重PCR检测方法。【本研究切入点】根据现代养鸡业快速发展及防病的需求，尤其针对临床症状相似且难以进行诊断的鸡病，应建立快速鉴别的诊断方法，但至今尚无针对NDV和APV二重RT-PCR检测方法的研究报道。【拟解决的关键问题】通过在NDV和APV两种病毒各自F基因保守区域设计2对特异引物，建立一次性可同时扩增鉴别二者的二重RT-PCR，为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

NDV标准毒株（LaSota株、F48E9株、I株）、禽呼肠孤病毒（Reo S1133）和禽大肠杆菌（E. coli O2）购自中国兽医药品监察所，NDV分离株（GX/2010和GX/2013）由广西动物疫病病原生物学与诊断重点实验室分离鉴定并保存提供，APV（MN-10毒株）由美国滨夕法尼亚大学Lu教授惠赠，鸡马立克氏病毒（MDV）疫苗毒购自南京梅里亚动物保健品公司，禽流感病毒H9（AIV H9）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV Mass 41）、鸡传染性喉气管炎病毒（北京株，ILTV）、禽脑脊髓炎病毒（AEV Van）和鸡毒霉形体（MG S6）均由广西动物疫病病原生物学与诊断重点实验室保存提供。SPF鸡胚（7～10日龄）是从北京梅里亚种禽有限公司购进SPF种蛋自行孵化获得。反转录酶AMV、RNA抑制剂、dNTPs、随机引物和2×Premix TaqTM Mix等购自宝生物工程（大连）有限公司，小量质粒提取试剂盒和胶回收纯化试剂盒购自美国Omega公司，其他试剂为进口或国产分析纯。

1. 2 引物设计与合成

根据GenBank已发表NDV的F基因序列（GenBank登录号JX840454）和APV的F基因序列（GenBank登录号AF187154），通过DNASTAR MegAlign对其序列进行比对分析，找出各自F基因的保守序列区间，应用PrimerSelect设计2对特异性引物（表1）。引物序列由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1. 3 病毒增殖及处理

1. 3. 1 NDV增殖及处理 NDV标准毒株（LaSota株、F48E9株、I株）用灭菌PBS按1∶1000进行稀释，然后经鸡胚尿囊腔分别接种10日龄SPF鸡胚，每胚0.2 mL，收集24～120 h死亡鸡胚尿囊液。鸡胚尿囊液经8000 r/min离心5 min，收集上清液用于RNA提取或-70 ℃保存备用。

1. 3. 2 APV增殖及处理 参照谢志勤等（2014b）的增殖方法进行操作。

1. 4 样品处理及RNA提取

取病鸡的肺脏、气管和脾脏等组织，按1∶5加入灭菌PBS进行研磨，研磨后的悬液分装于1.5 mL离心管中，-70 ℃下反复冻融3次（4 h内），8000 r/min离心5 min，收集上清液用于病毒增殖。病毒增殖后按Xie等（2005）的方法进行总RNA提取，提取的总RNA直接用于反转录（RT）或-20 ℃保存备用。

1. 5 RT-PCR扩增条件优化

对RT-PCR反应体系所用的Buffer、dNTPs、Mg2+、Random 9-mer（自由引物）、反转录酶AMV、RNA 抑制剂、RNA模板浓度、Taq DNA聚合酶及扩增程序的退火温度等进行优化，筛选出最佳的反应浓度及扩增条件。

1. 6 特异性及敏感性试验

以NDV标准毒株（LaSota株、F48E9株、I株）、APV/ MN-10毒株及AIV H9毒株、IBV Mass 41毒株、ILTV（Beijing）毒株、AEV Van毒株、MG S6毒株、Reo S1133毒株、E. coli O2菌株和MDV毒株的RNA或DNA为模板，进行RT-PCR或PCR扩增，检测二重RT-PCR的特异性。同时，测定NDV LaSota毒株和APV/MN-10毒株的RNA浓度，然后进行10倍梯度稀释，取100 ng～100 fg共7个稀释度的RNA（2.0 μL）为模板进行敏感性检测试验。

1. 7 临床样品检测

提取132份来自广西不同地区养鸡场病鸡肺脏、气管和脾脏样品的RNA，应用建立的二重RT-PCR对提取的样品RNA进行检测。同时，取相同样品研磨后以0.2 μm滤膜无菌过滤进行病毒分离，经卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚或经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，以评价二重RT-PCR对临床样品检测的实用性。

1. 8 序列分析比对验证

随机选取NDV和APV各2份PCR检测阳性样品产物进行序列测定比对，将回收纯化的PCR阳性产物与pMD18-T进行连接，然后转染大肠杆菌DH5α（TaKaRa公司）。提取转染质粒的DNA，经双酶切和PCR鉴定，阳性克隆送至宝生物工程（大连）有限公司测序，并采用DNASTAR对测序结果进行比对分析。

2 结果与分析

2. 1 二重RT-PCR产物检测结果

将12.0 μL二重RT-PCR产物（含2.0 μL加样缓冲液）加入预先用TBE（Tris 5.40 g，硼酸2.75 g，0.5 mol/L EDTA 2.0 mL）制备的1.5%琼脂糖凝胶孔中，以80 V/cm电压进行凝胶电泳，经Gelred染色后在紫外线下观察拍照，结果（图1）显示，NDV毒株样品约在240 bp处出现明亮条带，APV毒株样品约在420 bp处出现明亮条带，与预期结果一致。

2. 2 二重RT-PCR扩增条件优化

对二重RT-PCR反应体系各成分配比进行优化筛选，获得最佳的配比条件为：（1）反转录（RT）体系10.0 μL，即5×RT Buffer（含10 μmol/L dNTPs、Mg2+）2.0 μL，50 μmol/L Random 9-mer（自由引物）0.5 μL，反转录酶AMV 0.5 μL，RNA抑制剂0.5 μL，NDV LaSota毒株和APV/MN-10毒株的RNA模板各2.0 μL，灭菌的无RNA水2.5 μL。（2）PCR反应体系25.00 μL，即2×Premix TaqTM Mix12.50 μL（含10 μmol/L dNTPs、Mg2+、5 U Ex Taq DNA酶），RT产物2.00 μL，50 pmol/μL的APVF/APVR各0.25 μL，50 pmol/μL的NDVF/NDVR各0.25 μL，灭菌超纯水9.50 μL。同时，对不同退火温度（51、53、55、57、59和61 ℃）进行优化，确定最佳反转录程序：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min；最佳PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃1 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃结束反应。

2. 3 特异性及敏感性試验结果

参试的NDV LaSota毒株、F48E9毒株和I毒株均扩增出247 bp的特异性条带，APV/MN-10毒株扩增出424 bp的特异性条带，而AIV H9毒株、IBV Mass 41毒株、ILTV毒株、AEV Van毒株、MG S6毒株、Reo S1133毒株、E. coli O2菌株和MDV毒株在247和424 bp处均无特异条带出现（图1）。以10倍梯度稀释NDV LaSota毒株和APV/MN-10毒株的RNA为模板进行敏感性试验，结果发现二重RT-PCR最低能检测到10 pg的对应RNA模板（图2）。

2. 4 临床样品检测结果

对132份病鸡样品的RNA进行二重RT-PCR检测，结果显示有26份样品呈NDV阳性，2份样品呈APV阳性（图3），其中1份样品为NDV和APV混合感染，其余的104份样品均未检测出NDV或APV的特异条带。样品病毒分离后经血清學方法鉴定，发现有NDV阳性26份、APV阳性2份，与二重RT-PCR检测结果一致。

2. 5 序列分析结果

随机选取NDV和APV各2份PCR检测阳性产物进行序列测定，利用DNASTAR进行比对分析，结果表明，2份NDV阳性PCR产物与NDV（GenBank登录号JX840454）的F基因序列一致，同源性达100%；2份APV阳性PCR产物与APV（GenBank登录号AF187154）的F基因序列也完全一致，同源性达100%。

3 讨论

疫病防控一直是现代养鸡业的首要任务。除禽流感外，鸡新城疫也是一种必须防控的传染病，虽然我国对鸡新城疫已采取各种预防措施，但每年因该病引起的损失仍然十分巨大。相对于禽流感、鸡新城疫病等重大疫病，APV引起的疾病尚未引起人们足够重视。APV的最早报道是引起火鸡呼吸道疾病，随后在欧洲流行，死亡率高达25%～40%（Cook et al.，2000）。我国最早报道该病是在1998年（沈瑞忠等，1999），郭龙宗和曲立新（2009）进行血清学调查，发现我国鸡群中APV感染很普遍，感染率高的地区可达100%。APV和NDV引起的临床症状很相似，主要表现为上呼吸道症状，尤以喷嚏、眼结膜潮红、泪腺肿、产蛋下降、孵化率低及神经症状为主。因此，根据临床症状很难对二者进行鉴别，需通过实验室检测手段进行确诊，但目前尚无可同时检测鉴别APV和NDV的方法。

NDV和APV的融合蛋白（F）是非常重要的结构蛋白，其功能是参与细胞的吸附过程。虽然二者的融合蛋白（F）功能相同，但其蛋白序列结构并不一致，具有种属特异性，因此该蛋白常被用于检测鉴别病毒特征。本研究利用各自融合蛋白（F）的种属特异性，在其基因保守序列区域分别设计扩增NDV和APV的2对特异性引物，建立了一次扩增鉴别二者的二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果表明，参试的NDV LaSota毒株、F48E9毒株和I毒株均能扩增出247 bp的特异性条带，APV/MN-10毒株扩增出424 bp的特异性条带，而对照的AIV H9毒株、IBV Mass 41毒株、ILTV毒株、AEV Van毒株、MG S6毒株、Reo S1133毒株、E. coli O2菌株和MDV毒株在247和424 bp处均无特异条带出现，说明本研究建立的NDV和APV二重RT-PCR具有特异性，其最低检出限均为10 pg的RNA，表明其具有良好的敏感性。

为进一步验证本研究建立的二重RT-PCR，采用该方法对临床样品进行检测，结果发现有NDV阳性26份，阳性检测率19.69%（26/132），APV阳性2份，阳性检测率1.51%（2/132）。此外，通过对2份NDV阳性样品和2份APV阳性样品进行序列测定比对，证实所扩增的各自F基因序列片段正确，说明建立的二重RT-PCR具有很高的实用性，可用于临床检测，为快速鉴别检测NDV、APV及有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持。

4 结论

针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点，可用于临床快速鉴别诊断，为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持。

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（責任编辑 兰宗宝）