中国青凤蝶3个亚种的遗传变异分析

杨斯琦　王亚楠　王方方　何娅　靳亚丽

摘要[目的]探讨中国青凤蝶（Graphium sarpedon Linnaeus）3个亚种的遗传变异。[方法]对青凤蝶3个亚种的COⅠ基因和EF-1α基因部分序列进行测定，并对序列的碱基组成、转换颠换数和遗传距离等进行分析。[结果]在测得的COⅠ基因（709 bp）和EF-1α（1 064 bp）基因中，有44个变异位点，6个简约信息位点，COⅠ基因A+T平均含量为69.3%，存在较强的含量偏向性，亚种间的遗传距离相差甚小。[结论]青凤蝶3个亚种之间没有明显序列差异，仍然适宜采用传统的基于形态学的青凤蝶亚种分类体系。

关键词青凤蝶；COⅠ基因；EF-1α基因；遗传变异

中图分类号Q969.42文献标识码A文章编号0517-6611（2017）31-0156-04

Abstract [Objective]To investigate the genetic variation in three subspecies of Graphium sarpedon Linnaeus in China.[Method] The COⅠ gene and the EF1α gene were partially sequenced.The nucleotide composition， the number of transition and transversion， genetic distance of the segment had been analyzed.[Result]There were 44 variation sites and 6 parsimonyinformative sites in combined sequence of the COⅠ gene（709 bp）and EF1α（1 064 bp） gene in the examined species. The average A+T content of COⅠ gene was 69.3%，which showed strong A+T bias. But genetic distance among subspecies were very small.[Conclusion]It has no significant sequence differences between the three subspecies， which is still suitable to use the traditional morphological classification system for Graphium sarpedon subspecies.

Key wordsGraphium sarpedon；COⅠ gene； EF1α gene；Genetic variation

青凤蝶（Graphium sarpedon Linnaeus），又名樟青凤蝶或青带凤蝶，属于鳞翅目（Lepidoptera），凤蝶科（Papilionidae），青凤蝶属（Graphium），分布于我国陕西、湖北、湖南、四川、云南、贵州、西藏、江西、浙江、福建、广西、广东、海南、台湾、香港等地区[1]。青凤蝶在我国有3个亚种，即指名亚种[G.sarpedon sarpedon（Linnaeus）]、蓝斑亚种[G. sarpedon connectens（Fruhstorfer）]、斑带亚种[Graphium sarpedon semifasciatum（Honrath）]。目前对青凤蝶斑带亚种的分类尚存有争议，魏忠民等[2]通过对中国青凤蝶标本的观察，归纳出6种中国青凤蝶的变异型，描述其主要形态特征，认为青凤蝶的斑带亚种是一种变型，而不是亚种。对于青凤蝶亚种的争议问题，以DNA序列为基础的分辨依据研究较少。

目前国内外学者结合线粒体基因和核基因等分子标记

对昆虫类群的系统学研究已有大量的文献报道。线粒体DNA具有结构简单、进化速度快、高拷贝数、易于分离纯化等特点，是研究系统发育、种群遗传变异和分化、区分近缘种的重要工具[3]。由于线粒体基因是母系遗传，其中所含的进化信息并不能完全反映双亲进化的历史，核基因也含有丰富的生物学信息，结合适当的核基因将更好地分析蝶类的系统发育[4]。

笔者对我国分布的青凤蝶3个亚种的COⅠ基因和EF-1α基因部分序列进行测定，研究它们在DNA序列上的差异，以期为我国青凤蝶3个亚种分类地位提供分子证据。

1材料与方法

1.1材料

青凤蝶3个亚种的标本来自我国广西、上海，包括作为外群的木兰青凤蝶，共 15只成虫标本（表1）。

1.2方法

1.2.1提取基因组DNA及PCR扩增。

选取部分腹部或足部组织作为试验材料，采用试剂盒insect kit（Omega）提取基因组DNA，样品保存在-20 ℃备用。試验采用的引物序列如下。

COⅠ上游引物：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′；

下游引物：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3′。

EF-1α上游引物：5′-TCGATATCGCTTTGTGGAAGTT-3′；

下游引物：5′-ACGCACGGCAAAACGACCGAGAG-3′。

PCR 反应体积为50 μL，反应体系包括1.25 U的 Taq DNA聚合酶，0.2 mmol/L dNTP，上下游引物分别为0.4 μmol/L，10×PCR Buffer 为5 μL，模板 DNA 溶液 2 μL（50～100 ng DNA）。扩增条件为95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；最后在72 ℃延伸7 min，4 ℃保温。用 Eppendorf 梯度PCR仪进行扩增。

1.2.2PCR产物纯化、测序。

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，用DNA 凝胶回收试剂盒，对目的条带进行回收和纯化后，连接到T载体，经过转化挑克隆，提取质粒再委托上海赛默飞（Thermo Fisher）公司进行双向测序。

1.2.3序列分析及差异比较。

测定15只成虫标本的COⅠ和EF-1α基因部分序列，正反链序列拼接后，再Blast进行序列同源性比较，基于Kimura-2参数，采用MEGA6.0软件进行序列组成分析，如序列碱基组成（nucleotide composition）、保守位点（conservedsjtes）、变异位点（variable sjtes）、简约信息位点（parsimony information sites）、自裔位点（singletonsites）等。选择Tamurar Nei模型，计算各分类单元之间的遗传距离、转换数与颠换数比值（Ts/Tv）。

2结果与分析

2.1基因序列的确定

根据所选引物的位置，COⅠ基因和EF-1α基因预测扩增的片段分别是709 bp和1 064 bp，电泳检测的结果与预期相符（图1）。运用Blast对序列进行分

析，显示其与青凤蝶的COⅠ基因和EF-1α基因具有很高

的同源性。

2.2序列组成分析

除外群外，COⅠ基因部分序列共709 bp，变异位点6 bp，无简约信息位点，自裔位点6 bp，碱基组成上 T、C、A、G的含量分别是39.1%、16.5%、30.2%、144%，A+T平均含量为69.3%，其中密码子第2位点A+T含量最高，达90.5%，第2位点G含量最低，平均为0.4%，T含量最高，达49.0%，这表明密码子的碱基使用频率存在明显的偏向性（表2）。

核EF-1α基因部分序列共1 064 bp，变异位点38 bp，简约信息位点6 bp，自裔位点32 bp，T、C、A、G的含量分别是22.1%、28.6%、24.5%、24.8%，A+T平均含量为46.6%，其中第1位点含量最高，达到59.2%，第1位点G的含量最低，平均为15.2%，T的含量最高，达到28%，表明密码子的碱基使用频率也存在一定的偏向性（表3）。

通过Paup4.0b10软件对COⅠ基因和EF-1α基因进行PHT检验（同质性检验partition homogeneity test），结果显示基因进化水平不具有显著差异（P=1.0>0.01），因而可以将2组数据整合在一起进行分析。利用MEGA6.0软件，基于Kimura-2参数对COⅠ和 EF-1α基因部分序列的整合数据进行分析，统计碱基转换数与颠换数比值（R）。

由表4可知，核苷酸替換发生率比较低，第3位点略高，转换多于颠换，第1位点最保守。转换数与颠换数比值（R）平均为1.5<2，表现出较为明显的替换饱和。

2.3遗传距离分析

基于Kimura-2参数，采用MEGA 6.0计算个体间及亚种间的遗传距离（表5）。不含外群的个体两两之间的遗传距离在0.1%～0.5%，平均遗传距离是03%，将3个亚种进行分组后计算遗传距离，并与外群对照（表6），我国青凤蝶3个亚种间遗传距离是0.30%～034%，两两之间的遗传距离相差很小，其中指名亚种[G.sarpedon sarpedon（Linnaeus）]与斑带亚种[G.sarpedon semifasciatum（Honrath）]差异相对更小，与蓝斑亚种[G.sarpedon connectens（Fruhstorfer）]的差异相对更大。

2.4系统发育信号检测

采用碱基替换饱和性分析，对数据进行系统发育信号强弱的检测，以遗传距离为横坐标，以碱基转换数和颠换数为纵坐标作散点图（图2）。

从图2可以看出，随着遗传距离的增大，Ts增加的速度大于Tv增加的速度，且与遗传距离之间有良好的线性关系，Tv则逐渐趋于稳定，达到饱和。

通过Paup4.0b10软件对数据做PTPtest序列信息检验，结果显示P为0.002，表明该数据具有较显著的系统发育信息，而非随机数据，可用来进行系统发育的推断[5-6]。

3讨论

我国青凤蝶分布有3个亚种，据《中国蝶类志》中描述，青凤蝶的形态特征为翅窄长，底色黑，无尾状突起，前后翅中央贯穿1列略呈方形的蓝绿色斑（后翅前面的1个为白色），后翅外缘有1列绿蓝色的新月斑。后翅反面近翅基有1条红色短线，翅中部至后缘处有数条红色斑纹。

3个亚种之间形态特征存在一些差异，青凤蝶蓝斑亚种的绿色斑偏蓝，前翅顶角有1个绿斑特别小；斑带亚种的后翅色带不全。有学者提出青凤蝶的斑带亚种是一种变型，而不是亚种。为此，该研究联合2个基因序列的整合数据对青凤蝶3亚种间遗传变异进行了分析。之所以选择COⅠ和EF-1α基因联合分析，一方面是增加系统发生分析的置信度[7-8]，另一方面也与2个基因各自的特点有关。线粒体COⅠ是编码线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ的基因，是常用的分子标记之一，它既相对保守又存在高变区，高变区内遗传进化速率更快，种间的遗传差异也更明显，适合于种间和种内分类鉴定及系统发生研究[9]。EF-1α基因进化速度比较快，它也用于分析低阶元的系统发育，已有学者做了相关的研究，如Reed等[10]用线粒体COⅠ、COⅡ基因的全长和核基因的EF-1α基因联合分析了凤蝶科凤蝶属23个种和亚种的个体。

在鳞翅目同种个体之间，COⅠ基因的差异为025%[11]，从试验结果来看，我国青凤蝶3个亚种间COⅠ基因相似

度为 99.15%，核苷酸差异很小，表明COⅠ基因在个体间变异率较低。3个亚种间EF-1α基因相似度96.43%，表明存在一定的变异率。3亚种青凤蝶在形态上的差异可能

是由于地理隔离形成，其自身的遗传变异性非常低[12]。

从系统发育树的拓扑结构看，其未显示3个亚种间有很好的单系性，而出现了并系性，且各支自举检验值较低（<50%），因而没有列出发育树，置信度低下可能是因为分子数据所提供的信息位点较少[13]，或者是COⅠ基因和EF-1α基因序列突变达到饱和。结合对3个亚种基因序列两两距离进行P-distance计算，并按照亚种分组后计算遗传距离，可以看出指名亚种和斑带亚种的亲缘关系较近，但不足以认定斑带亚种是属于指名亚种的一种变型。

综上所述，结合目前已有的2个基因部分序列和各亚种之间形态特征的差异，仍然适宜采用传统的基于形态学的青凤蝶亚种分类体系。

参考文献

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