层出镰孢菌原生质体制备条件的研究

高美玲 刘阳 于海宁 侯红漫 包永明

摘要[目的]研究层出镰孢菌（Fusarium proliferatum）原生质体的最佳条件，建立高效制备层出镰孢菌原生质体制备的方法。[方法]通过对菌丝体菌龄、酶解液组合、酶解反应温度及酶解时间等影响因素进行优化，对层出镰孢菌原生质体的制备条件进行研究。[结果]菌块在CMC液体培养基中25 ℃培养分生孢子3 d后，过滤离心后转移至YEPD液体培养基中培养12 h，该菌丝最适于层出镰孢菌原生质体的制备；用1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/mL裂解酶、25 mg/mL崩溃酶、0.05 mg/mL溶壁酶的酶解液在30 ℃下对菌丝酶解1.5 h，此时原生质体的数量最大，为2.47×109 个/mL。原生质体再生培养时，使用40% PTC溶液恢复细胞壁，在TB3液体培养基中30 ℃过夜培养，离心后与TB3固体培养基混合后倒入平板培养，原生质体再生率可达39.75%。[结论]通过对菌丝体菌龄、酶解液浓度、温度、酶解时间等条件的优化，可提高层出镰孢菌原生质体的产量及再生率，为进一步研究层出镰孢菌致病分子机制提供理论依据。

关键词层出镰孢菌；原生质体制备；原生质体再生；优化

中图分类号S432.4文献标识码A文章编号0517-6611（2017）35-0149-03

Abstract[Objective] The aim was to study the optimum conditions for the preparation of protoplasts of Fusarium proliferatum， and to establish efficient methods for preparing protoplast. [Method] The preparation conditions of protoplast of Fusarium proliferatum were studied by optimizing the factors including the hypha culture time， enzyme mixtures， enzymolysis reaction temperature and enzymolysis time. [Result] The result showed that mycelia was cultured in CMC liquid medium for three days at 25 ℃， and then the conidia was transferred to YEPD liquid medium for 12 hours， which was suitable for the preparation of protoplast of Fusarium proliferatum；The enzyme mixture containing 5 mg/mL lysing enzyme， 25 mg/mL driselase and 0.05 mg/mL lywallzyme was dissolved in 1.2 mol/L KCl solution；The enzymolysis reaction temperature was 30 ℃ and enzymolysis time was 1.5 h， the yield of protoplast was the highest， and the number of protoplasts was 2.47×109 protoplasts/mL. When the protoplast was regenerated， 40% PTC solution was used to restore the cell wall， and incubated in TB3 liquid medium at 30 ℃ overnight. After centrifugation， the cells were mixed with TB3 solid medium and poured into plate culture. The protoplast regeneration rate was 39.75%. [Conclusion] The yield and regeneration rate of protoplast of Fusarium proliferatum were improved by optimizing the conditions such as hypha culture time， enzyme mixtures， enzymolysis reaction temperature and enzymolysis time， and also provide theory basis for further study on pathogenicity molecular mechanism of Fusarium proliferatum.

Key wordsFusarium proliferatum；Protoplast preparation；Protoplast regeneration；Optimization

層出镰孢菌（Fusarium proliferatum）是一种世界范围内导致众多粮谷类植物病害的重要病原菌，并具有广泛的宿主范围，该病原菌可引起番茄叶斑病[1]、玉米穗腐病[2]、大豆根腐病[3]等。层出镰孢菌代谢过程中产生多种有害的真菌毒素，对多种作物的食品安全性构成威胁，也是生产上较难防治的重要病害之一。由于镰孢菌种类较多，同属不同种镰孢菌在生物学特性、遗传多态性和致病机理等方面也存在较大差异。目前，国内外对层出镰孢菌的研究多集中于病原菌鉴定分类[4-7]、生物学特性[8]、毒素[9-10]等方面，但对层出镰孢菌原生质体制备尚未见系统的研究报道，这在一定程度上限制了从分子水平对层出镰孢菌进行深入的研究。因此，建立一种高效、稳定的层出镰孢菌原生质体制备方法，有利于对层出镰孢菌进行功能基因组学的研究及其侵染植物宿主时产生的致病因子及效应子进行深入的分子机制研究。

笔者采用菌丝体酶解法对层出镰孢菌原生质体制备过程中菌龄、酶解液组合、酶解反应温度、酶解时间等条件进行优化，建立一套适用于层出镰孢菌原生质体制备及再生的方法，用于后期研究。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株。层出镰孢菌，菌株编号为K140108，分离自辽宁省大连绿晨水果蔬菜合作社（121°26E，38°89N）番茄温室大棚的病叶，经单孢分离后，由大连理工大学生命科学与技术学院基因工程实验室保藏。

1.1.2培养基。PDA固体培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L；CMC液体培养基：羧甲基纤维素（CMC）15 g/L，硝酸铵（NH4NO3）1 g/L，磷酸二氢钾（KH2PO4）1 g/L，七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g/L，酵母提取物1 g/L；YEPD液体培养基：酵母提取物3 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L；TB3液体培养基：酵母提取物3 g/L，酸水解酪蛋白3 g/L，蔗糖300 g/L；TB3固体培养基：酵母提取物3 g/L，酸水解酪蛋白3 g/L，蔗糖200 g/L，琼脂10 g/L。以上培养基配制后，121 ℃高压灭菌20 min备用。

1.1.3

主要试剂。酶解液：用10 mL 1.2 mol/L KCl溶液配制含有5 mg/mL裂解酶（Lysing enzyme，Sigma公司），25 mg/mL崩溃酶（Driselase，Sigma公司）及0.05 mg/mL溶壁酶（Lywallzyme）的酶解液，室温下175 r/min振荡30 min，4 000 r/min离心8 min，用0.22 μm 细菌过滤器过滤除菌后备用。

STC 缓冲液：蔗糖100 g，0.5 mol/L Tris-HCl（pH 80）50 mL，CaCl2·2H2O 3.675 5 g，加ddH2O定容至500 mL，混匀后121 ℃高压灭菌20 min，4 ℃保存。

PTC缓冲液：称取40 g PEG 8000，溶解于STC缓冲液中，定容至100 mL，65 ℃水浴锅加热完全溶解后，用0.22 μm细菌过滤器过滤除菌，4 ℃保存。

1.2方法

1.2.1菌体培养。从保存于斜面上的菌株中挑选少量菌丝接种于PDA固体培养基上进行活化，25 ℃培养3～5 d，用接种环取4块直径为5 cm的菌丝块接种至100 mL CMC液体培养基中，25 ℃、150 r/min摇动培养。用无菌microcloth过滤培养3 d的孢子悬浮液于50 mL无菌离心管中4 000 r/min离心8 min，倒掉上清液，用YEPD液体培养基重新悬浮孢子，25 ℃、150 r/min摇动培养，用于后续原生质体的制备。

1.2.2原生质体制备。取YEPD液体培养基培养的菌丝分别用双层无菌microcloth中间夹3层无菌擦镜纸进行过滤，再用无菌水洗涤2次后，各取0.5 g转移至装有10 mL酶解液的离心管中，30 ℃、90 r/min摇动培养酶解菌丝壁释放原生质体，每隔0.5 h取20 μL用血球计数板在显微镜下观察计数；停止酶解后，用1层无菌microcloth和2层擦镜纸过滤酶解混合物到无菌50 mL离心管中，并用1.2 mol/L KCl缓冲液冲洗，尽可能将原生质体洗下来；室温下4 000 r/min離心8 min，倒掉上清液；加入10 mL STC缓冲液轻微重悬，4 000 r/min离心8 min；去上清液后，沉淀即为原生质体，再重悬于1 mL STC缓冲液中，然后用血球计数板在显微镜下观察，进行计数；用STC缓冲液将原生质体悬液稀释至1×107 个/mL。

1.2.3原生质体制备条件的优化。

1.2.3.1菌龄。在YEPD液体培养基中分别取培养时间为8、12、16、20、24 h的菌丝过滤用于原生质的制备。

1.2.3.2酶解液组合。用不同组合的酶酶解培养时间为12 h菌丝，分别为：①5 mg/mL裂解酶；②5 mg/mL裂解酶+0.05 mg/mL溶壁酶；③25 mg/mL崩溃酶；④5 mg/mL裂解酶+25 mg/mL崩溃酶；⑤25 mg/mL崩溃酶+0.05 mg/mL溶壁酶；⑥5 mg/mL裂解酶+25 mg/mL崩溃酶+0.05 mg/mL溶壁酶。

1.2.3.3

酶解反应温度。用3种混合酶对12 h的菌丝酶解2 h，酶解温度分别为20、25、30、35和40 ℃。

1.2.3.4酶解时间。

用3种混合酶对12 h的菌丝进行酶解，酶解时间分别为30、60、90、120、150 min。

1.2.4原生质体再生。取200 μL制备好的原生质体稀释液，加入1 mL 40% PTC缓冲液用于恢复细胞壁，轻柔混合均匀，室温静置20 min后，再加入10 mL TB3液体培养基，25 ℃黑暗条件下90 r/min摇床过夜培养；4 000 r/min离心8 min，弃去上清液，加入15 mL 55 ℃的TB3固体培养基，混匀后倒入平板，25 ℃下培养2～3 d平板上会长出单菌落，计数，并计算原生质体再生率。加入上述原生质体稀释液同样体积的无菌水作为对照组，进行如上操作后，涂布于TB3固体培养基作为对照组。每个试验重复3次，取3次结果的平均值。

原生质体再生率=（原生质体再生菌落数-对照组菌落数）/原生质体总数×100%

2结果与分析

2.1层出镰孢菌菌龄对原生质体制备的影响

处于不同生理时期和状态的层出镰孢菌菌丝对裂解酶的敏感性有较大的差异。因此，要保证菌丝体生理状态相对一致的生长期。李华等[11]报道，对数生长期的菌体代谢旺盛，并且对酶的敏感性强，比稳定期及衰亡期更适用于原生质体的制备。因此，该试验将斜面上的菌株接到PDA固体培养基上进行活化后，接到CMC液体培养基中摇孢子，再接到YEPD液培养基中，目的是使孢子能够同时萌发生成时期一致的菌丝，培养8 h开始，每隔4 h取100 mL过滤菌丝制备原生质体，结果见图1，在12 h时获得的原生质体数量最大，16～20 h时，在显微镜下观察原生质体数量越来越少，24 h时发现很多菌丝体生长时间过长，菌壁较厚，裂解不完全，故原生质体的数量明显下降。

2.2不同酶解液组合对层出镰孢菌原生质体制备的影响

采用6种酶解液组合对培养12 h的层出镰孢菌菌丝进行酶裂解，使溶解菌体细胞壁释放出原生质体。结果见表1，单一使用裂解酶、崩溃酶的裂解效率远不如酶组合。当5 mg/mL裂解酶、25 mg/mL崩溃酶、0.05 mg/mL溶壁酶3种酶共同作用时，裂解最完全，而且比其他酶组合裂解所用的时间少，释放出来的原生质体数量最多，可达22.43×108 个/mL。

2.3酶解温度对层出镰孢菌原生质体制备的影响

酶的活性对温度较为敏感，因此，酶解温度对酶解液裂解菌丝的速率有直接的影响。在适宜的温度条件下，酶活性高，有利于提高原生质体的产量。该试验用5 mg/mL裂解酶+25 mg/mL崩溃酶+0.05 mg/mL溶壁酶这一组合的酶解液处理菌龄为12 h的菌丝。结果表明，层出镰孢菌原生质体的产量随着温度的升高而不断增加，在30 ℃时达到最高，但在30 ℃以后，随着温度的升高，原生质体的得率呈下降趨势（图2）。由此可见，30 ℃条件最适合酶解液裂解菌丝，获得的原生质体数目最高。

2.4酶解时间对层出镰孢菌原生质体制备的影响

酶解时间的长短对原生质体的释放和再生有直接的影响，酶解时间短，菌丝壁不能完全裂解，释放的原生质体数目较少，但酶解时间过长，则会出现原生质体破裂的现象，从而导致原生质体不能再生，因此，选择适宜的酶解时间尤为重要。在30 ℃条件下，使用3种酶混合裂解液对菌龄为12 h的菌丝进行酶解。由图3可知，30 min时在显微镜下观察到未被酶解的菌丝较多，有极少数原生质体被释放出来；随着酶解时间的逐渐增加，释放出的原生质体数目增加，在90 min时获得的原生质体数量最多，120 min后原生质体的数量明显下降。在显微镜下观察（图4），90 min是层出镰孢菌裂解原生质体的最佳时间。

2.5层出镰孢菌原生质体的再生

将制备好的原生质体在25 ℃下缓慢振荡过夜培养，TB3液体培养基可以很好地维持原生质体的渗透压，为原生质体再生提供有利条件。将再生的原生体悬浮于TB3固体培养基，24 h后可肉眼观察到菌丝在培养基表面长出，原生质体再生率可达39.75%。

45卷35期高美玲等层出镰孢菌原生质体制备条件的研究

3结论与讨论

层出镰孢菌K140108是从番茄病叶上分离出的一株致病性较强的病原菌，已通过RNA-Seq技术对该病原菌与宿主互作时产生的致病基因和效应基因进行分析，因此，建立和制备高效大量的层出镰孢菌原生质体用于致病基因和效应基因的功能验证尤为重要。目前，镰孢菌属中已有很多菌种制备出高效的原生质体，如禾谷镰孢菌[12]、尖孢镰孢菌[13]等。但镰孢菌种类较多，同属不同种的镰孢菌在制备原生质体的方法上也存在一定差异。因此，通过研究酶解法制备层出镰孢菌的原生质体，可用于后续该菌的致病基因功能研究。

菌丝体菌龄、酶解液组合、酶解反应温度和酶解时间是影响原生质体数量的重要因素。为获得高质量的层出镰孢菌原生质体，该研究对以上4个因素逐一进行研究。结果表明，将在PDA培养基上活化的菌丝块接到CMC液体培养基中培养3 d可获得大量分生孢子，再将其悬浮于YEPD液体培养基中培养12 h，此时获得的菌丝生长阶段一致，并且此时的菌体幼嫩，细胞壁易于酶解。在研究酶解液组合因素时，该试验对单一酶和混合酶进行比较。结果表明，裂解酶和崩溃酶分别使用时均可以裂解得到原生质体，但酶解效率远不如两者混合使用。此外，单一酶裂解用时较长，甚至会使原生质体破裂。当裂解酶、崩溃酶和溶壁酶共同使用时，原生质体的数量达到最高。在确定了菌体菌龄和酶解液组合的基础上，该试验还研究了酶解温度和时间对原生质体数量的影响。酶解液的活性受温度的直接影响，适宜的酶解温度可使酶解液的活性达到最高[14]。该研究结果表明，30 ℃时酶解90 min可得到最大数目的原生质体，并且再生率可达3975%。

该研究中层出镰孢菌原生质体制备的最佳条件如下：5 mg/mL裂解酶、25 mg/mL崩溃酶、0.05 mg/mL溶壁酶的酶解液组合在30 ℃下对在YEPD液体培养基中培养菌龄为12 h的菌丝酶解90 min，获得原生质体的数目最大，为2.47×109 个/mL，原生质体再生率为39.75%，可用于对层出镰孢菌中致病基因和效应基因的功能验证。

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