环境因素对杨梅叶原花色素的稳定性影响

过尘杰　傅瑜

摘 要：杨梅叶原花色素有良好的抗氧化活性，具有作为功能性成分应用于化妆品、医药与食品领域的可能性。本文主要研究环境因素中的光照、温度、pH和金属离子对杨梅叶原花色素稳定性的影响，对杨梅叶原花色素的实际应用进行初步探究。通过设计不同环境因素的对照试验，利用香草醛-硫酸法测定原花色素含量的变化，以此为依据对稳定性进行研究。结果发现，外界条件中，自然光、D65（人工日光）和UV（紫外光）光源会一定程度上降低稳定性；60℃以下的温度在短时间内对稳定性几乎没有影响；在pH值为4.3～8.0范围内，杨梅叶原花色素趋于稳定；杨梅叶原花色素对Cu2+、Fe2+、Mg2+、Pb2+这四种常见金属离子十分敏感。因此，楊梅叶原花色素若要作为功能性成分应用于工业生产，如下的环境条件有利于保持其稳定性：避光，60℃以下的温度，pH值为4.3～8.0范围内，避免Cu2+、Fe2+、Mg2+、Pb2+这四种金属离子。

关键词：杨梅叶；原花色素；稳定性

1 背景

杨梅（Myrica rubra Sieb. et Zucc）是我国的特色果树之一，枝叶繁茂，但其研究多以鲜果加工为主，每年都有大量的杨梅叶被修剪丢弃。实际上，杨梅叶中含多种酚类化合物，主要由黄酮类化合物及原花色素类化合物组成，加以提取利用，可以变废为宝[ 1 ]。

原花色素（Proanthocyanidins）具有良好的抗氧化活性，可以通过清除自由基、螯合金属离子、调节酶活性等方式达到调节生理功能的效果。原花色素对美容与皮肤保健的作用也是十分显著的[ 2-4 ]。

原花色素的的稳定性容易受到光照、温度、pH、金属离子等环境因素的影响。目前有关杨梅叶原花色素的研究报道极少，对其稳定性方面的研究也较少。原花色素易被氧化，常用于提高其稳定性的物质主要有VC等抗氧化剂，在加工和贮藏过程中研究原花色素变化规律保持其稳定性至关重要[ 5 ]。

本文主要研究光照、温度、pH、金属离子等环境因素对杨梅叶原花色素稳定性的影响，通过各个影响因素的不同处理，香草醛-硫酸法测定原花色素含量的变化，以此为依据对稳定性进行研究。

2 材料与方法

2.1 实验仪器

层析柱：Sephadex LH-20，300 × 25 mm，GE Healthcare Bio-Sciences AB（Sweden）；

冷冻干燥机：LABCONCO，美国；

紫外-可见光分光光度计：UV-2550，日本岛津；

标准光源箱：Tilo标准光源箱，深圳市天友利标准光源有限公司。

2.2 实验试剂

丙酮，甲醇，正己烷，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙醇，1%（w/v）香草醛甲醇溶液，20%（v/v）硫酸甲醇溶液，柠檬酸，氢氧化钾，硫酸镁，硫酸亚铁，醋酸铜，醋酸铅等。

2.3 实验方法

2.3.1杨梅叶原花色素的制备

杨梅叶粉末用70%（v/v）的丙酮溶液浸提4h，40℃旋转蒸发除去丙酮，再用等体积正己烷和二氯甲烷萃取，以去除色素，脂肪和其他非酚类物质后。萃取后所得水相旋转蒸发除去有机溶剂并浓缩后冷冻干燥，得到杨梅叶原花色素粗提物。

称取5g原花色素粗提物溶解在50%甲醇溶液中，上样于层析柱。依次用50%甲醇洗脱去除糖类物质，90%甲醇洗脱去除大部分黄酮类物质，50%丙酮洗脱得到原花色素类物质。将50%丙酮洗脱得到的馏分经旋转蒸发除去丙酮后冷冻干燥[ 7 ]，即得到实验所需的杨梅叶原花色素。

2.3.2光照对杨梅叶原花色素稳定性的影响

研究避光、自然散射光、D65光源、UV光源4种光照条件对杨梅叶原花色素稳定性的影响。首先，配制0.5 mg/mL 的杨梅葉原花色素溶液，装入透光性良好的玻璃试管中密封。分别置于暗室（避光）、室内（避免阳光直射）、标准光源箱（D65/UV）内，分别经过24h、72h后取出测定原花色素含量，之后每3d测定一次，直到第15d，每次测定做3次平行[ 8 ]。

2.3.3 温度对杨梅叶原花色素稳定性的影响

配制0.5 mg/mL 的杨梅叶原花色素溶液 50mL，等量装入带塞试管中，将它们分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃水浴条件下，保温处理2h后测定原花色素含量，平行测定3次，取平均值[ 8 ]。

2.3.4 pH对原花色素稳定性的影响

配制0.5 mg/mL的杨梅叶原花色素溶液，于室温下用0.1mol/L柠檬酸和0.1mol/L NaOH调节pH，配制成pH值分别为3.22、4.32、5.22、6.18、7.55、8.05、9.71的7组试液，于30℃恒温水浴中静置2h，测定各组原花色素含量，平行测定3次，取平均值[ 8 ]。

2.3.5 金属离子对杨梅叶原花色素稳定性的影响

配制0.5 mg/mL的杨梅叶原花色素溶液，Cu2+、Mg2+、Fe2+按照离子浓度分别为0.1、1.0、5.0和10.0mmol/L配制金属离子盐溶液，Pb2+则按照0.01、0.1、0.5和1.0mmol/L的浓度配制溶液，加入等量杨梅叶原花色素，于30℃恒温水浴中静置2h，测定原花色素含量，平行测定3次，取平均值[ 5 ]。

2.3.6原花色素含量测定

香草醛-硫酸法测定各个馏分的原花色素含量[ 9 ]。

用移液枪准确吸取2ml待测液（记录2mg/mL），置于10ml 具塞试管中，加入2.5mL浓度为1%（w/v）的香草醛甲醇溶液，混匀后加入2.5ml浓度为20%（v/v）硫酸甲醇溶液，混匀，置于30 ℃水浴中反应15min，在500nm处测定吸光值。空白为2 mL甲醇，测定方法同上。样品中原花色素含量以每克样品（干重）中所含毫克当量（+）-儿茶素表示。

2.4 数据统计

采用Excel 2007进行数据分析，DPS进行数据分析。

3 结果与分析

3.1 光照对杨梅叶原花色素的稳定性影响

由表1可知，避光条件下原花色素含量下降最慢，15d后原花色素含量为初始值的65.2%，UV照射下的原花色素在15d后剩余最少，仅为原来的22.8%，自然光与D65处理的样品在15d后，分别剩下37.3%和31.3%。而且，实验过程中发现，UV光源照射下的样品在试管底部有沉淀生成，可能的原因是原花色素分子间发生聚合反应形成大分子，其分子量较大溶解度较小，从而生成沉淀，原花色素含量降低[ 5 ]。

观察可知，15d中，置于暗室中的样品其原花色素含量一直保持最高，自然散射光处理的样品也一直比D65照射处理的样品所含原花色素高，在6d之后，自然散射光與D65光源照射下的样品的原花色素含量下降趋势减缓，UV光源下的则从12d开始才有减缓趋势，这与吴朝霞[ 10 ]、赵建国[ 5 ]的实验结果相符。此外，根据以上变化趋势可以判断，虽然前9d中，自然光与D65处理的样品所含原花色素都略低于UV处理的样品，但从大概11d开始，UV照射处理的样品所含的原花色素量是四个处理中最低的。

所以，杨梅叶原花色素在贮存时要注意避光，尽可能减小由光照造成的对其稳定性的破坏。

3.2 温度对杨梅叶原花色素的稳定性影响

由图1可知，80℃以内温度对原花色素的稳定性影响不大，这与李润丰等人的实验结果相符[ 11 ]。在30～60℃之间，各温度对杨梅叶原花色素的稳定性几乎没有影响，60℃之后，原花色素的含量开始有小幅度的下降，可能是由于原花色素的间苯二酚结构在热作用下被破坏，无法与香草醛发生缩合反应，进而无法呈色，导致吸光度值降低。因此，在杨梅叶原花色素的加工利用过程中应尽量避免高温，尤其是80℃以上的高温。

3.3 pH对杨梅叶原花色素的稳定性影响

由图2可知，当pH在4.3～8.0范围内时，原花色素的含量变化不大。杨梅叶原花色素溶液自身的pH为6.18，呈弱酸性。随着酸度或碱度的增加，原花色素含量均有下降，当pH在4.3～8.0范围外下降趋势尤为明显。由此可见，杨梅叶原花色素对酸碱比较敏感，在接近其本身pH值附近的范围内比较安全，过酸或过碱都会导致原花色素含量的降低，这与张建立，李公春[ 12 ]的研究结果相一致。

3.4 金属离子对杨梅叶原花色素的稳定性影响

金属离子对原花色素的影响巨大。

实验中发现，加入1mmol/L的Cu2+溶液时，会即刻产生较多的棕黄色絮状沉淀；

加入1mmol/L的Fe2+溶液时，会即刻产生大量的深蓝色絮状沉淀；

加入1mmol/L的Mg2+溶液时，无沉淀生成；

加入0.1mmol/L的Pb2+溶液时，会产生少量的白色沉淀。

添加四种金属离子后，样品的原花色素含量均大幅下降。分析以上现象的可能原因，由于黄酮类化合物分子中常含有酚轻基和γ-毗喃酮环，故常可与铝盐、锆盐、铅盐、镁盐、铁盐等试剂反应，生成有色络合物[ 10 ]。

结合表2与实验现象可知，加入这四种金属离子溶液后，即使是所设置的系列浓度中浓度最低的金属离子溶液，原花色素也会即刻被破坏，含量快速降低，接近于零。因此在原花色素的提取、精制和加工中应尽量避免Cu2+、Fe2+、Mg2+、Pb2+的存在。

4 小结

本文共研究了4个环境因素对杨梅叶原花色素稳定性的影响。分析以上结果可知，避光条件下杨梅叶原花色素的稳定性是最好的；60℃以下的温度在短时间内对稳定性几乎没有影响；在pH值为4.3～8.0范围内，杨梅叶原花色素趋于稳定；对于Cu2+、Fe2+、Mg2+、Pb2+这四种常见离子，杨梅叶原花色素都十分敏感。

杨梅叶原花色素的稳定性受多方面因素的影响，本研究在尽可能控制其它变量相同的条件下单独比较了各个影响因素的影响结果，但在实际中，需要将这些因素综合考虑，以此达到提高杨梅叶原花色素稳定性的目的，帮助杨梅叶原花色素可以更好的应用到实际的加工利用中。

杨梅树在南方被大量种植，杨梅叶作为废弃材料，来源广，价格低，而且富含酚类物质，具有抗氧化、抗菌抗病毒等生物活性，是一种具有开发潜力的植物资源。

本文从开发利用杨梅叶的角度出发，提取杨梅叶中的原花色素，研究各类因素对其稳定性的影响，为杨梅叶原花色素在化妆品、医药与食品领域的应用打下基础。

参考文献：

[1] 杨海花.杨梅叶原花色素的研究[D].杭州：浙江大学生物系統工程与食品科学学院， 2012：108-109.

[2] 张长贵，董加宝，王祯旭.原花色素及其开发应用[J].四川食品与发酵，2006，42（1）：8-12.

[3] 万本屹，董海洲，刘传富.原花青素及其应用[J].中国食物与营养，2001， 6： 15-16.

[4] 张长贵，董加宝，谢伍容.原花色素抗氧化生物活性研究进展[J].粮食与油脂，2009，6：10-12.

[5] 赵国建.石榴籽原花色素提取纯化及其功能性研究[D].陕西：西北农林科技大学，2009：64-75.

[6] 刘有停，张鹏.化妆品基质原料对α-熊果苷美白功效及稳定性的影响[J].日用化学工业，2012，42（1）：51-54.

[7] Yang， H.， Ye， X.， Liu，D.， et al.（2011）. Characterization of unusual proanthocyanidins in leaves of bayberry（Myrica rubra Sieb. et Zucc.）.Journal of Agricultural and Food Chemistry，59（5）：1622-1629.

[8] 王庆玲，罗小玲，颜海燕，等.花生红衣中低聚原花色素稳定性的研究[J].现代食品科技，2010，12（8）：847-849.

[9] Sun，B. S.，Ricardo da Silva，J. M， et al.（1998）.Critical factors of vanillin assay for catechins and proanthocyanidins.Journal of Agricultural and Food Chemistry，46（10）：4267-4274.

[10] 吴朝霞.葡萄籽原花色素分离提纯、组分鉴定及抗氧化研究[D].沈阳：沈阳农业大学，2005：57-66.

[11] 李润丰，吕晓玲，李凤英，等.葡萄籽原花色素的稳定性分析[J].河北科技师范学院学报，2005，19（4）：35-37.

[12] 张建立，李公春.迎春花黄色素稳定性研究[J].湖北农业科学，2013，52（7）：1625-1627.

作者简介：过尘杰（1990-），女，汉族，浙江绍兴人，硕士，毕业于香港中文大学食品营养与科技专业，助教，主要从事食品营养、食品分析方面的研究。