多倍体西瓜染色体制片技术改良及其核型分析

李桂芬　何毅　覃斯华　黄金艳　柳唐镜　洪日新　李天艳　樊学军　韦正光　李文信

摘要：【目的】改良多倍体西瓜染色体标本制片技术，比较多倍体西瓜常规核型分析与荧光核型分析结果，为西瓜细胞遗传学研究及辅助构建西瓜物理遗传图谱提供参考依据。【方法】以多倍体西瓜为材料，以传统染色体制片方法去壁—低渗火焰干燥法为基础，去掉其前低渗和后低渗两个步骤，合并其再固定与火焰涂片两个步骤，用吉姆萨染色剂和荧光染料DAPI分别对多倍体西瓜染色体进行常规染色和荧光染色，并进行核型分析。【结果】使用改良型酶解去壁火焰干燥法进行多倍体西瓜染色体制片，比传统去壁—低渗火焰干燥法简化了用KCl溶液前低渗、后低渗及用卡诺固定液再固定3个步骤，可缩短制片时间1.0～2.0 h，提高制片效率，获得的染色体样本数目齐全、分散良好、形态清晰。用DAPI染色比用吉姆萨染色更容易检测到细胞中期分裂相，每张玻片可缩短检测时间0.5～1.5 h；染色体的着丝点、长臂及短臂形态更清晰。【结论】采用改良染色体制片方法可提高多倍体西瓜染色体的制片效率，对该制片进行荧光核型分析比常规核型分析更准确，效率更高。

关键词： 多倍体西瓜；染色体制片；荧光染色；核型分析

中图分类号： S651 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）04-0663-06

Abstract：【Objective】Technique of chromosome preparation for polyploid watermelon was improved，conventional karyotype and fluorescence karyotype for polyploid watermelons were compared in order to provide reference for research on genetics of watermelon and establishment of physical genetic map of watermelon. 【Method】Polyploid watermelons were used as materials in the study. Based on traditional chromosome preparation technique， namely wall degradation-hypotonic flaming-drying method， pre-hypotonic and after-hypotonic were deleted， and re-fixation and flame smear were combined into one procedure. Giemsa stain and DAPI fluorescence stain were used to stain， and carried out conventional karyotype analysis and fluorescence karyotype analysis respectively. 【Result】The optimized enzymolysis flaming-drying method was used to prepare chromosome of polyploid watermelons. Compared with the traditional technique， the optimized one simplified three procedures which were pre-hypotonic and after-hypotonic of KCL solution and re-fixation by Carnoy fixative. Thus the time was 1.0-2.0 h shorter. Production efficiency was improved， and samples with complete amount， good dispersion and clear configuration were obtained. Slides stained with DAPI could shorten the detection time for 0.5-1.5 h each slide， and were more easily to be detected metaphases with more clear centromere，long arm and short arm of chromosome than stained with Giemsa. 【Conclusion】The modified method can improve the efficiency of chromosome preparation of polyploid watermelon. Fluorescent karyotype analysis is more accurate and efficient than conventional karyotype analysis.

Key words： polyploid watermelon； chromosome preparation； fluorescence stain； karyotype analysis

0 引言

【研究意義】多倍体西瓜一般包括三倍体无籽西瓜和四倍体西瓜，具有比二倍体西瓜适应性广、抗逆性强、含糖量高、无籽、耐贮运和产量高等优势（谭素英等，1994；刘文革等，2009）。多倍体西瓜染色体制片技术和核型分析是西瓜细胞学的重要研究内容，但传统染色体制片技术常用的压片法制片很难获得数目齐全、分散良好、形态结构清晰的染色体样本，由此获得的核型分析数据也不够准确，而改良型酶解去壁火焰干燥法能克服这些缺点。因此，进行多倍体西瓜染色体制片技术改良及常规和荧光核型分析，对西瓜的倍性鉴定和倍性育种均具有重要意义。【前人研究进展】多年来，由于西瓜染色体较小、细胞质浓厚，致使染色体制片难度大，尤其是多倍体西瓜染色体制片难度更大，效果不佳（肖光辉等，1997；张志忠和吕柳新，2009）。不同倍性水平的鉴定方法有染色体直接计数法和间接鉴定法，间接鉴定法包括细胞形态学鉴定法（谭素英等，1994）、高温和低温胁迫法（郭启高等，2000）、流式细胞测定法（施先锋等，2010）和植物形态学鉴定法（袁建民等，2013），但间接检测西瓜倍性方法的直观性和准确性均比染色体直接计数法差（刘文革等，2009）。直接观察西瓜体细胞染色体不仅可统计染色体的数目，还可观察到各染色体的形态并进行核型分析。目前针对多倍体西瓜制片方法及核型分析的研究较少，主要是采用压片法（赵虎基等，2000；徐道娜等，2007；江姣等，2012；袁建民等，2013）制作二倍体西瓜的染色体标本并进行核型分析，而对于西瓜这种小染色体作物，压片法很难获得数目完整、形态清晰、分散良好的染色体中期分裂相，由此进行的核型分析也不够准确。国内外学者利用荧光染料DAPI（4'-6-二脒基-2-苯基吲哚）已成功构建了蕹菜（刁英等，2005）等植物的染色体模式图，揭示了染色体上AT富含的区域并识别特定染色体（Belonogova and Karamysheva，2006；谢莉等，2008）。【本研究切入点】截至目前，鲜见针对西瓜细胞学研究和荧光核型分析的报道。【拟解决的关键问题】以多倍体西瓜为材料，采用改良型酶解去壁火焰干燥法进行染色体制片，用吉姆萨染料和荧光染料DAPI分别染色，对比常规核型分析和荧光核型分析的优缺点，为西瓜倍性鉴定和倍性育种提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

二倍体、三倍体和四倍体西瓜种子由广西农业科学院园艺研究所提供，取其根尖作染色体制片材料。染色体光学和荧光显微镜有奥林巴斯BX53（日本奥林巴斯株式公社）、尼康相差荧光显微镜80i（日本尼康公司）、徕卡荧光显微镜DM2500（德国徕卡公司）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 染色体制片 将陈瑞阳等（1979）的去壁—低渗火焰干燥法染色体制片技术加以改良，简化为改良型酶解去壁火焰干燥法进行染色体制片。

1. 2. 2 荧光染色 将用改良型酶解去壁低渗火焰干燥法制片获得的染色体样本玻片晾干，用0.1 μg/mL DAPI在室温下染色10 min，滴加20 μL丙三醇至载玻片上，盖上1.5 cm×1.5 cm盖玻片，用指甲油封边。

1. 2. 3 染色体检测及图像处理 用荧光显微镜奥林巴斯BX53、尼康相差荧光显微镜80i、徕卡荧光显微镜DM2500进行染色体光学和荧光检测并拍照，用Photoshp进行染色体图片调整、染色体分离和排列，用Digimizer测量染色体短臂和长臂的长度。

1. 2. 4 核型分析 每种西瓜材料观察50个以上中期分裂相并进行染色体计数，选取5个分散良好的中期分裂相，用光学和荧光显微镜在100倍油镜下拍照。根据李懋学和陈瑞阳（1985）的标准进行体细胞染色体中期核型分析，着丝粒位置参照Levan等（1964）的标准进行命名；核型不对称性按Stebbins（1971）的标准进行分类。

2 结果与分析

2. 1 多倍体西瓜染色体制片技术的改良

载玻片前处理：将载玻片用洗衣粉煮沸30 min以上，湿布擦洗表面，放入重铬酸钾洗液浸泡2 d以上，进一步清洗载玻片上的杂质，捞出载玻片用去离子水漂洗去除铬酸洗液，放入4 ℃去离子水中保存。

催芽取根：用清水常温浸泡西瓜种子6～8 h，用湿布包裹放入恒温箱中，33 ℃催芽24 h，待胚根长1～5 cm时用镊子夹取根尖分生区约5 mm。

根尖预处理：将夹取的根尖浸入0.002 mol/L 8-羟基喹啉中，室温避光处理 3～4 h，双蒸水洗涤2～3次。

固定：用现配的固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）固定4 h。

酶解：酶解前将根尖置于去离子水中浸泡20 min去除残留固定液，同时切除分生区外的根区，留下长约1 mm的白色分生区（白点），再移至盛有3%纤维素酶和2%果胶酶混合液的1.5 mL离心管中，将离心管放入33 ℃水浴锅中酶解4～5 h，用去离子水小心清洗根尖2～3次，去除残留酶液。

涂片：用滴管小心吸取一个或几个酶解后的根尖，置于干净的载玻片上，滴加几滴卡诺固定液驱散玻片上的水分，用带齿的长嘴眼科镊子快速反复夹挤根尖约5 s，使分生区细胞均匀分布在载玻片中央，用镊子去除表皮细胞等杂质，固定液未干前再滴加1滴卡诺固定液，轻吹固定液进一步分散载玻片上的细胞浆，然后将载玻片置于酒精灯火焰上方来回烘烤约3 s，待载玻片上卡诺固定液燃烧，将载玻片移开火焰，放入玻片盒中风干。

染色和镜检：①常规染色用10%吉姆萨染液染色5～10 min，风干载玻片后即可用普通光学显微镜100～400倍镜检；②荧光染色用0.1 μg/mL DAPI室温染色10 min，晾干载玻片后滴加20 μL丙三醇，盖上1.5 cm×1.5 cm盖玻片，用指甲油封边，最终获得不同倍性西瓜染色体标本，用荧光显微镜紫外激发通道镜检。

2. 2 不同倍性西瓜的核型分析

采用改良型酶解去壁火焰干燥法获得的不同倍性西瓜染色体标本，其染色體数目完整，分散均匀，形态清晰，着丝点、长臂和短臂均易识别（图1），说明该改良型染色体制片方法虽简化了前低渗、后低渗和再固定3个步骤，但不影响染色体制片的成功率，可节约制片时间1.5～3.0 h，因此提高了染色体制片效率。

对比常规染色与荧光染色效果（图1-D～F）发现，相对于常规染色，经荧光染色后不同倍性西瓜染色体制片背景更干净，反差明显，染色体着丝点和端部的轮廓更清晰，因此更容易识别和测量，核型分析数据更准确。其中，三倍体西瓜染色体荧光带型尤为清晰，荧光亮度柔和（图1-E）；二倍体和四倍体西瓜染色体存在一定的散射荧光（图1-D、图1-F）。不同倍性西瓜的DAPI带型染色面积均较大，阴性带与阳性带差异不明显，未显现出明显的荧光带型。

比较常规核型分析与荧光核型分析数据（表1）发现，不同倍性西瓜的荧光核型与常规核型差异不明显，除三倍体西瓜荧光核型包含1组近中部着丝点染色体（sm）外，其他材料的核型均由中部着丝点（m）染色体组成，二倍体西瓜核型公式为2n=2x=22m，三倍体西瓜核型公式为2n=3x=33m或2n=3x=30m+3sm，四倍体西瓜核型公式为2n=4x=44m。不同倍性西瓜最长与最短染色体的比值为1.24～1.55，小于2.00，臂比值大于2.00的染色体比率为0。按照Stebbin核型分类标准判断，本研究所有试验材料的核型均属于1A型，为基本对称型，说明西瓜的系统进化演化程度较低，导致其遗传背景狭窄。

2. 3 常规核型分析与荧光核型分析的效果比较

常规核型分析是指以常规染色剂进行染色后再进行核型分析。常规染色剂包括吉姆萨、醋酸洋红、卡宝品红和石碳酸品红等染色剂。其中，吉姆萨染色法是在制片后对载玻片进行染色，先以磷酸盐溶液预染10～30 min，再以10%～20%的工作液染色5～10 min；而醋酸洋红、卡宝品红或石碳酸品红染色法是在压片前对解离后的根尖、茎尖等制片材料进行整体染色，然后以45%冰醋酸进行分色、压片，最后用光学显微镜镜检。常规染色法的优点：染料价格低廉，染色效果持久。其缺点是：核型分析数据不够准确；染色液配制有一定难度，染色时间较长，易在制片过程中产生杂质染色，导致镜检时视野杂乱，镜检效率低，每检测一张玻片平均耗时1.0～2.0 h；染色体的着丝点和端部轮廓不够清晰，导致核型分析数据准确性较低。

荧光核型分析是指以荧光染色剂进行染色后再进行核型分析。荧光染色法一般使用DAPI或PI滴加到染色体样本玻片上，室温染色约10 min，再盖上盖玻片，即可用荧光显微镜进行镜检。荧光染色法的优点：染色速度快；镜检效率高（每检测一张玻片平均耗时仅0.5 h）；分析数据准确；制片过程中产生的杂质无法染色，镜检时视野内只有明亮细胞分裂相点缀在深色背景上，反差明显，可快速准确地搜寻到染色体中期分裂相；经荧光染色的染色体，DAPI带主要出现在染色体的端部和着丝粒位置，少数带位于染色体中间位置（Huang et al.，2007），可准确识别染色体着丝点和端部轮廓，精准测量染色体长臂、短臂长度进行核型分析。其缺点是：需荧光显微镜和荧光染料，因此试验成本较高。此外，由于荧光染料容易猝灭，以高倍镜观察细胞分裂相时，荧光会越来越暗，因此需添加抗荧光衰竭剂封片以延缓荧光衰退。

3 讨论

植物染色体制片技术已相对成熟，但常规染色体制片技术和核型分析仍存在不足之处（李桂芬，2011；李桂芬等，2013）。本研究采用二倍体西瓜为对照，在陈瑞阳等（1979）的去壁—低渗火焰干燥法基础上，对三倍体和四倍体西瓜的染色体制片技术进行简化，并用荧光染料DAPI和吉姆萨染色剂分别染色，对比荧光核型分析与常规核型分析结果的异同。

西瓜的染色体多数为中部着丝点染色体，形态非常相似，同时各品种间染色体的大小无明显区别（赵虎基等，2000；袁建民等，2013），缺乏染色体标志和次级结构如次缢痕。本研究获得的二倍体和四倍体西瓜核型与前人的研究结果（张成福等，1987；赵虎基等，2000；李琦等，2007；袁建民等，2013）基本相同，仅各染色体的相对长度和绝对长度有所差异，可能与试验方法不同有关。本研究发现，三倍体西瓜核型包含一组sm染色体，可能是杂交组配的父母本基因型差异所致，未见前人有类似研究报道，因此需进一步探究核实。

此外，不同倍性西瓜荧光核型未显现出明显的荧光带型，4种碱基的分布相对较均匀，AT富含区或GC富含区相对较少，因此很难出现非常清晰且稳定的阳性带或阴性带。同时，三倍体西瓜荧光带型较二倍体和四倍体西瓜清晰，可能是使用的荧光染料及检测仪器不同所造成（三倍体西瓜染色体用DAPI纯溶液染色，用尼康相差荧光显微镜检测；二倍体和四倍体西瓜染色体用含封片剂的DAPI杂合溶液染色，用莱卡荧光显微镜检测）。

有报道应用Giemsa—C带技术可分辨一些西瓜品种的同源染色体（张成福等，1987；郑素秋，1988），以5S rDNA和45S rDNA为探针的FISH法也可成功鉴别两个基因组（李琦等，2007；常珂玮等，2012；江姣等，2012），但西瓜染色體核型图具有相似性使其同源染色体的鉴别比较困难，而一些作物的GISH（基因组原位杂交技术）带型可同时呈现FISH带和Giemsa—C带，表明可将GISH带型作为核型分析的细胞学标志（Marasek-Ciolakowska et al.，2012）。鉴于西瓜染色体核型的高度相似性，常规核型分析、荧光核型分析均无法准确鉴别每条染色体，在后续工作中，应将改良多倍体西瓜染色体制片技术、荧光核型分析技术与GISH结合起来，通过基因定位，提供更清晰稳定的染色体标记来实现西瓜染色体的区分鉴定及揭示在育种过程中遗传变异的来源、染色体的渗入和多倍体的来源等染色体行为。

4 结论

以改良型酶解去壁火焰干燥法进行多倍体西瓜染色体制片较使用传统的去壁—火焰干燥法简化了用KCl溶液前低渗、后低渗及用卡诺固定液再固定3个步骤，可缩短制片时间1.0～2.0 h，提高制片效率，获得的染色体样本数目齐全、分散良好、形态清晰；用DAPI染色比用吉姆萨染色更容易检测到细胞中期分裂相，每张玻片可缩短检测时间0.5～1.5 h；染色体的着丝点、长臂、短臂形态更清晰。因此，采用改良型酶解去壁火焰干燥法可提高多倍体西瓜的染色体制片效率，对该制片进行荧光核型分析比常规核型分析更准确，效率更高。

参考文献：

常珂玮，沈君君，李宗芸，韩永华. 2012. 西瓜与近缘种亲缘关系的比较基因组原位杂交分析[J]. 植物科学学报，30（4）：402-406.

Chang K W，Shen J J，Li Z Y，Han Y H. 2012. Genomic homo-

logy between Citrullus lanatus and its close relatives revealed by comparative genomic in situ hybridization[J]. Plant Science Journal，30（4）：402-406.

陈瑞阳，宋文芹，李秀兰. 1979. 植物有丝分裂染色体标本制作的新方法[J]. 植物学报，21（3）：297-298.

Chen R Y，Song W Q，Li X L. 1979. A new method for prepa-

ring mitotic chromosomes from plant[J]. Acta Botanica Sinica，21（3）：297-298.

刁英，陈思，黄雨蝶，周明全，胡中立. 2005. 蕹菜的DAPI显带核型[J]. 氨基酸和生物资源，27（1）：32-34.

Diao Y，Chen S，Huang Y D，Zhou M Q，Hu Z L. 2005. DAPI banded karyotype of Ipomoea aquantica Forsk（I. reptans Poir）[J]. Amino Acids & Biotic Resources，27（1）：32-34.

郭启高，宋明，杨天秀，梁国鲁. 2000. 西瓜试管苗中四倍体鉴定方法研究[J]. 西南农业大学学报，22（3）：261-262.

Guo Q G，Song M，Yang T X，Liang G L. 2000. Study on identification mentihods for tetraploids from tube cultured seedlings of watermelon（Citrullus vulgaris）[J]. Journal of Southwest Agricultural University，22（3）：261-262.

江姣，张海英，郭绍贵，任毅，孙宏贺，宫国义，许勇，赵泓. 2012. 普通西瓜3个变种45S rDNA和5S rDNA的染色体定位[J]. 果树学报，29（5）：764-769.

Jiang J，Zhang H Y，Guo S G，Ren Y，Sun H H，Gong G Y，Xu Y，Zhao H. 2012. Chromosomal polymorphism of ribosomal genes in the genus watermelon[J]. Journal of Fruit Science，29（5）：764-769.

李桂芬. 2011. 枇杷属植物远缘杂交及核型分析研究[D]. 广州：华南农业大学.

Li G F. 2011. A study on karyotype analysis and distant hybri-

dization compatibility of genus Eriobotrya plants[D]. Guang-

zhou：South China Agricultural University.

李桂芬，梁国鲁，林顺权. 2013. 枇杷属植物核型分析及其在系统分类中的应用[J]. 园艺学报，40（8）：1468-1474.

Li G F，Liang G L，Lin S Q. 2013. A study on karyotype analysis of genus Eriobotrya and its application to systematic taxonomy[J]. Acta Horticulturae Sinica，40（8）：1468-1474.

李懋学，陈瑞阳. 1985. 关于植物核型分析的标准化问题[J]. 武汉植物学研究，3（4）：297-302.

Li M X， Chen R Y. 1985. A suggest on the standadization of karyotype analysis in plants[J]. Journal of Wuhan Botanical Reseach，3（4）：297-302.

李琦，马璐，黄婧，李立家. 2007. 西瓜、苦瓜与罗汉果染色体的rDNA定位及其核型分析[J]. 武汉大学学报（理学版），53（4）：449-456.

Li Q，Ma L，Huang J，Li L J. 2007. Chromosomal localization of ribosomal DNA sites and karyotype analysis in three species of Cucurbitaceae[J]. Journal of Wuhan University（Natural Science Edition），53（4）：449-456.

刘文革，阎志红，赵胜杰，古勤生，李丽. 2009. 不同染色体倍性西瓜对枯萎病的抗性研究[J]. 长江蔬菜，（18）：19-20.

Liu W G，Yan Z H，Zhao S J，Gu Q S，Li L. 2009. Study on resistance to Fusarium wilt in different polyploidy of watermelons[J]. Journal of Changjiang Vegetables，（18）：19-20.

施先锋，彭金光，李煜华，曾红霞，杜念华，汪李平. 2010. 西瓜多倍体鉴定方法的研究[J]. 浙江农业科学，（2）：273-275.

Shi X F，Peng J G，Li Y H，Zeng H X，Du N H，Wang L P. 2010. Studies on the methods of identification of polyploid watermelon[J]. Zhejiang Agricultural Sciences，（2）：273-275.

谭素英，黄秀强，刘文革. 1994. 三倍体无籽西瓜的优越性及系列无籽西瓜新品种[J]. 中国西瓜甜瓜，（4）：22-23.

Tan S Y，Huang X Q，Liu W G. 1994. The superiority of triploid seedless watermelon and a series of new seedless waterme-

lon varieties[J]. China Watermelon and Melon，（4）：22-23.

肖光輝，肖兰异，吴德喜，郑素秋，许勇，陶抵辉，王杏元. 1997. 瓠瓜DNA导入西瓜变异后代的同工酶和染色体分析[J]. 中国西瓜甜瓜，（3）：8-11.

Xiao G H，Xiao L Y，Wu D X，Zheng S Q，Xu Y，Tao D H，Wang X Y. 1997. Isozyme analysis and chromosome variation of watermelon progeny imported bottle gourd DNA[J]. China Watermelon and Melon，（3）：8-11.

谢莉，曾艷华，李冬郁，韩永华. 2008. 栽培高粱、甜高粱和拟高粱前中期染色体DAPI显带核型[J]. 安徽农学通报，14（15）：48-50.

Xie L，Zeng Y H，Li D Y，Han Y H. 2008. DAPI banded karyo-

type of prometaphase chromosomes in S. bicolor，S. dochna and S. propinquum[J]. Anhui Agricultural Science Bulletin，14（15）：48-50.

徐道娜，薛志强，李世栋，马建祥，杨建强，张勇，张显. 2007. 西瓜染色体压片技术改进研究[J]. 西北农业学报，16（6）：301-304.

Xu D N，Xue Z Q，Li S D，Ma J X，Yang J Q，Zhang Y， Zhang X. 2007. Study on chromosome pressing technology improve-

ment in watermelon[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，16（6）：301-304.

袁建民，党选民，詹园凤，李易蓉，但忠，杨长楷. 2013. 二倍体及同源四倍体小果型西瓜核型分析[J]. 北方园艺，（23）：40-43.

Yuan J M，Dang X M，Zhan Y F，Li Y R，Dan Z，Yang C K. 2013. Karyotype analysis of diplod and autotetraploid mini-watermelon[J]. Northern Horticulture，（23）：40-43.

张成福，马正谭，魏晓明，郭德栋. 1987. 西瓜粗线期染色体形态[J]. 北方园艺，（1）：7-10.

Zhang C F，Ma Z T，Wei X M，Guo D D. 1987. Chromosome morphology of watermelon in rough line[J]. Northern Horticulture，（1）：7-10.

张志忠，吕柳新. 2009. 西瓜第一染色体显微分离及其特异文库的构建[J]. 热带作物学报，30（12）：1083-1087.

Zhang Z Z，Lü L X. 2009. Microdissection of the first chromosome and construction of its DNA library in watermelon[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，30（12）：1083-1087.

赵虎基，乐锦华，李红霞，魏凌基. 2000. 西瓜种染色体核型与品种（系）间亲缘关系研究[J]. 北方园艺，（1）：22-23.

Zhao H J，Yue J H，Li H X，Wei L J. 2000. Studies on karyotype of clanatus and genetic relationships amone varieties[J]. Nor-

thern Horticulture，（1）：22-23.

郑素秋. 1988. 西瓜三品种染色体Giemsa-C带带型和核型观察初报[J]. 中国西瓜甜瓜，（1）：24-26.

Zheng S Q. 1988. A preliminary report on the chromosome Giemsa-C band pattern and karyotype of three watermelon varieties[J]. China Watermelon and Melon，（1）：24-26.

Belonogova N M，Karamysheva T V. 2006. Identification of all pachytene bivalents in the common shrew using DAPI staining of synaptonemal complex spreads[J]. Chromosome Research，14（6）：673-679.

Huang X T，Hu J J，Hu X L，Zhang C，Zhang L L，Wang S，Lu W，Bao Z M. 2007. Cytogenetic characterization of the bay scallop，Argopecten irradians，by multiple staining techniques and fluorescence in situ hybridization[J]. Genes Genetic Systems，82（3）：257-263.

Levan A，Fredga K，Sandberg A A. 1964. Nomenclature for centromeric position on chromosomes[J]. Hereditas，52（2）：201-220.

Marasek-Ciolakowska A，He H，Bijman P，Ramanna M S，Arens P，Van Tuyl J M. 2012. Assessment of intergenomic recombination through GISH analysis of F1，BC1 and BC2 progenies of Tulipa gesneriana and T. fosteriana[J]. Plant Systematics and Evolution，298（5）：887-899.

Stebbins G L. 1971. Chromosomal Evolution in Higher Plants[M]. London：Academic Press.

（责任编辑 思利华）