鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定与药敏试验

秦绪伟　吴昊　王蕾　刁有祥

摘要：2017年3月，山东潍坊某养殖场养殖肉鸭15000X，发生急性死亡、神经症状、厌食为主要特征的疾病，经实验室解剖化验、细菌的分离鉴定、分子生物学的鉴定，最终确诊为鸭里默氏杆菌病，经药敏试验，选择敏感性高的药物治疗，最终控制了病情。

关键词：鸭里默氏杆菌病；鉴定；毒力；药敏

中图分类号：S858.23 文献标识码：B 文章编号：2096-3637（2017）05-0002-03

鸭里氏杆菌病又称为鸭传染性浆膜炎，是由鸭疫里默氏杆菌引起的幼鸭的一种急性传染病，主要侵害1～8周龄的小鸭，是造成幼鸭死亡的主要传染病之一。鸭疫里默氏杆菌，菌体呈现杆状或者椭圆，菌体大小为0.3～0.5×0.7～6.5um，也有的呈现长丝状，可以达到11～24um。细菌少数呈现短链排列或者成双排列，多数呈现单个存在，可形成荚膜，无鞭毛，革兰氏染色呈现阴性，瑞氏染色可见细菌呈现两极浓染。鸭疫里默氏杆菌的生长营养要求比较高，普通的琼脂平板、麦康凯平板、SS琼脂平板不生长，细菌分离时需要在5%二氧化碳环境中分离，37℃培养24h以上。

鸭疫里氏杆菌发病主要是发生在2～3周龄的小鸭，一年四季都有发生，各种应激都会促进疾病的发生，饲养密度大、环境卫生差、饲养管理不善、维生素缺乏等原因都会造成疾病的发生，剖检明显症状以纤维素性心包炎、肝周炎，严重的引起气囊炎以及有的发病鸭可以出现干酪性输卵管炎、关节炎，死亡率高，耐过的鸭生长迟缓、饲料报酬低，该病成为养殖场养鸭业影响比较大疫病。

2017年3月，山东潍坊某肉鸭养殖场，养殖15日龄的肉鸭15000只，开始有少量死亡，每天死亡10只左右，未引起重视，以为环境变化、天气原因引起的发病，发病都为急性死亡，3d后死亡率开始增加，每天死亡50多只、100多只，严重的死亡每天300只，发病表现有的精神萎靡、神经症状、厌食、嗜睡、缩颈，部分发病的鸭子表现眼睛浆液性或者粘液性的分泌物，眼睛周围羽毛脱落，鼻孔有粘液或者浆液性的分泌物，粪便稀薄，两腿伸直或者尾部摇摆，不久后抽搐死亡。解剖可见急性病例心包液严重增多，心包外膜可见纤维素的渗出物，严重的整个心包都是纤维素包裹，纤维素渗出物呈现干酪样。肝脏表面包裹一层灰白色黄色的纤维素膜，容易剥离，肝脏严重的肿大，质地较脆易碎。气囊全部浑浊，有纤维素膜。脾脏有的肿大，严重的有纤维素膜包裹，质地易碎。养殖场发病后开始死亡较少未引起重视，后来发病增多，来实验室化验，最终经细菌的分离鉴定、确诊为鸭疫里默氏杆菌引起的鸭浆膜炎病，经药敏试验选择敏感的药物，最终治疗效果良好。后期还进行的鸭疫里默氏杆菌的生化试验、PCR鉴定，细菌血清型的鉴定、细菌的毒力试验，了解鸭疫里默氏杆菌的基本特性。

1材料和方法

1.1试验菌株

山东某肉鸭养殖场，发生死亡的病例，临床上急性发病，解剖可见严重的心包炎、肝周炎，疑似鸭疫里氏杆菌病，留取病料，细菌分离，作为实验菌株。

1.2试验动物

14日龄樱桃谷鸭，购自德州临邑某养殖场。

1.3器材

生物安全柜，购白苏净安泰；全自动样品快速研磨仪，购自上海净信科技；基因扩增仪，购自杭州博日科技有限公司；恒溫培养箱，购自三洋；显微镜，购自奥林巴斯。

营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂，马丁肉汤粉，购自青岛海博试剂公司；细菌微量生化反应小管，购自北京路桥试剂公司；微量药敏片，购自杭州天和生物试剂有限司；犊牛血清，购自内蒙古金源康试剂公司；革兰氏染色液、瑞氏染色液，按照规程在实验室自行配制；1型、2型、7型鸭疫里默氏杆菌阳性定型鉴定血清，齐鲁动保研究所制备，已与标准品验证；解剖台、解剖刀、剪刀、酒精灯、接種环、试管、高压锅、超声波清洗机，实验室常备物品。

1.4细菌分离与鉴定

养殖场鸭子发生神经症状、急性死亡的病例，解剖可见严重的包心包肝，无菌条件下进行肝脏的细菌分离，接种环挑取肝脏组织分别接种10%血清营养琼脂平板、普通营养琼脂平板、麦康凯平板、ss琼脂平板，放置37℃二氧化碳培养箱培养24h-48h，观察有无细菌生长，若有细菌生长则记录细菌菌落的生长情况，进行细菌的革兰氏染色、瑞氏染色，观察细菌形态。

1.5生化试验

将分离的疑似鸭疫里默氏杆菌从血清营养琼脂平板挑取单个菌落，接种10%血清马丁肉汤培养基，接种后37℃温箱振荡培养24h，取样接种微量生化反应小管，接种后24h～48h观察记录结果。糖发酵试验是将菌液接种糖发酵小管，每只管0.2ml，观察7d；硫化氢试验是将细菌穿刺接种醋酸铅培养基，观察培养基是否变黑；过氧化氢酶试验，是用接种环取固体培养基上的菌落，置于洁净的试管内，滴加2m13%过氧化氢，观察是否有气泡产生；甲基红试验是将细菌接种到蛋白胨水中，37℃培养24h，观察颜色的变化。

1.6血清型鉴定

方法是使用平板凝集试验，接种环挑取血清平板的单个菌落，与一滴血清1型、2型、7型阳性定型血清在玻璃平板上混合，混合后1min观察有无凝集现象，如果与血清1型血清凝集则判定为1型鸭疫里默氏杆菌，如果与血清2型血清凝集则判定为2型鸭疫里默氏杆菌，血清7型血清凝集则判定为7型鸭疫里默氏杆菌。

1.7药敏试验

挑取血清琼脂平板上的菌落，使用接种环挑取菌落在另外一个血清平板上均匀涂布，将有各种药物的药敏片贴于琼脂上，置37%温箱放置24h～48h，观察抑菌圈的大小，确定药物的敏感性。

1.8PCR病毒检测

将发病鸭的肺脏、脾脏、肝脏适量研磨，冻融后进行基因扩增PCR检测，检测流感、腺病毒、黄病毒、鸭肝炎病毒。

1.9细菌16SrRNA

将血清平板分离的单个细菌接种加血清的马丁肉汤培养基，温箱37℃震荡培养36h，取1ml，加热煮沸7min，冰浴5min，离心取上清作为基因扩增的模板，设计引物：F1-5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3.R1-5ACGGCTACCTTG TTG TTA CGA CTT-3，PCR反应体系（50u1）：10*PCRBuffer（含MgC1215mmol/L，KC1500mmol/L）5ul，2.5mmol/LdNTP 4ul，引物（20umol/10各1ul，模板2ul，ddH2036.8ul，Taq酶（5U/u1）0.25ul。PCR反应条件：94℃5rain；94℃lmin，56℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。取PCR产物进行电泳检测，测序公司检测，根据测序结果Genbank比对，确定细菌为何种细菌。

1.10毒力试验

将分离的1型鸭疫里默氏杆菌接种含有10%血清的营养琼脂平板，放置37℃温箱培养48h后，接种加血清的马丁肉汤培养基，37～C温箱摇床培养36h，取菌液将菌液稀释成1X108CFU/ml，5X107CFU/ml，2X107CFU/ml，1X107CFU/ml，进行肌肉注射14日龄的幼鸭5只，1ml/只，攻毒后观察7d，记录发病死亡情况，同时饲养5只同日龄幼鸭作为对照，若发现有扭颈、角弓反张的神经症状则判定发病。

2结果

2.1细菌分离和培养特性结果

发生鸭子急性死亡病例，肝脏涂片革兰氏染色镜检，可见阴性小杆菌。肝脏病料无菌接种血清营养琼脂平板，在二氧化碳培养箱培养约36h可见细小的菌落生长，透明露珠样菌落，平板上菌落圆形、凸起，瑞氏染色可见两极浓染，革兰氏染色呈现阴性菌落，普通营养琼脂平板、麦康凯、ss琼脂平板不生长。

2.2生化试验结果

血清平板挑取单个细菌，接种加血清的马丁肉汤培养基，取适量接种微量生化反应小管，接种后24h～48h观察结果，不发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖，硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、VP试验、甲基红试验、硫化氢产生、尿素分解阴性，氧化酶、触酶试验阳性。（具体结果见表1）

2.3血清型鉴定结果

分离的细菌与血清1型的定型血清凝集，与血清2型、血清7型的定型血清不凝集，确定分离的细菌为1型鸭疫里默氏杆菌。

2.4细菌的药敏试验结果

将鸭疫里默氏杆菌的均匀涂布于含10%血清的营养琼脂平板，将含有相应药物的药敏片贴于琼脂上，37"C温箱培养36h，可见明显的抑菌圈，根据抑菌圈的大小判定分离细菌对药物的敏感程度，头孢噻肟钠、头孢噻呋钠、磷霉素、阿莫西林、青霉素高敏，氧氟沙星、恩诺沙星、强力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素中敏，林可霉素、壮观霉素低敏，红霉素、庆大霉素、链霉素不敏感。（具体药敏结果见表2）

2.5PCR病毒检测结果

病料研磨处理后，PCR检测最终流感、腺病毒、黄病毒、鸭肝炎病毒全部为阴性，发病鸭子没有感染这4种病毒。

2.6细菌16SrRNA检测结果

分离的细菌处理后，PcR扩增产物测序，最后进行结果确定为鸭疫里默氏杆菌。

2.7毒力实验结果

分离的1型鸭疫里默氏杆菌，分别按照1X108CFU/ml，5X107CFU/ml，2X107CFU/ml，1X107CFU/ml稀释剂量进行攻毒，腹腔注射1ml，每组5只，攻毒后观察7d，其中IX108CFU/ml攻毒剂量组开始精神沉郁、食欲减退，第3d、第4d全部死亡，死亡前鸭子扭颈、角弓反张、瘫痪等神经症状，解剖可见心脏、肝脏轻度的纤维素渗出；5X107CFU/ml攻毒剂量组开始精神沉郁、食欲减退，慢慢开始发病，第4d、第5d全部死亡，死亡的鸭子有鸭子扭颈、角弓反张、瘫痪等神经症状，解剖可见心脏、肝脏的纤维素渗出；2X107CFU/ml攻毒剂量组开始精神沉郁、食欲减退，慢慢开始发病，第4d、第5d死亡2只，死亡的鸭子有鸭子扭颈、角弓反张、瘫痪等神经症状，解剖可见心脏、肝脏的严重纤维素渗出，另外3只有适当的精神沉郁、食欲减退，观察7d见活；1X107CFU/ml攻毒剂量組，，有1只第4d开始精神沉郁、食欲减退，第2d恢复，其他4只观察7d精神、食欲未见明显的变化，分离的鸭疫里默氏杆菌对樱桃谷肉鸭的最小致死量为5X107CFU，最小发病剂量是2X107CFU，1X107CFU剂量不能引起14日龄的樱桃谷鸭发病。对照组5只观察7d，未见精神食欲有任何变化。（具体药敏结果见表3）

3小结与讨论

3.1鸭疫里默氏杆菌属于环境致病菌

是鸭养殖过程中的一种常见的疾病，一般的发病群体是幼鸭，一年四季都可以发生，发病的诱因是各种应激因素，饲养密度过大、环境通风不良、垫草潮湿、饲料品质不良、环境温度忽高忽低、维生素缺乏等等因素都会造成疾病的发生，另外一些疾病大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、鸭病毒性肝炎等疾病也会与鸭疫里默氏杆菌的一起发生，形成继发感染。鸭疫里默氏杆菌传染源主要是污染的饲料、垫草等，可以通过呼吸道、消化道传播，养殖场发病一般有明显的疫点，从一个点爆发，向周边发生蔓延。

3.2鸭疫里默氏杆菌的发病临床主要症状

是神经症状、角弓反张、瘫痪，解剖症状主要是心包炎和肝周炎，在疾病诊断时需要鉴别诊断。其中引起临床神经症状的疾病有流感、巴氏杆菌、鸭肝炎、维生素B1缺乏等，引起心包炎肝周炎的疾病有大肠杆菌、沙门氏菌等，仅仅依靠临床的观察和解剖很难确诊，需要仔细的结合临床症状、发病情况区别诊断，必要时需要进行实验室的细菌分离和病毒检测才能确诊。一旦发生疾病，结合神经症状和心包炎肝周炎可以初步诊断为鸭疫里默氏杆菌病，进行PCR基因扩增病毒的检测流感和鸭肝炎检测可以区别，细菌性的大肠杆菌和沙门氏菌却别需要进行细菌的分离，通过细菌分离鉴定可以区别这几种细菌。

3.3養殖场一旦发生疾病

一般开始时症状不明显，容易别忽略，一旦发生起来，死亡率较高，若不能确诊是何种疾病，盲目地投药更会加重病情。因此一旦发生疾病，需要及时诊断，必要时需要实验室的化验，确诊疾病，针对性的治疗，进行药敏试验，选择敏感性高的药物，及时准确地治疗疾病，这样才能控制疾病。对于发病较多的疫区，可以选择使用疫苗进行防疫，鸭疫里默氏杆菌有21个血清型，但是国内报道的主要发病血清型是1型、2型和7型，在发病较多的养殖场可以适当的选择，有必要可以将发病的鸭子送有资质的单位检测，是否是国内常见的发病血清型。

3.4该病的预防关键

是减少应激，不要促进疾病的发生，可以选择使用药物预防，疫苗也是一个不错的选择，不同的养殖场可以根据自己的实际情况，综合管理，饲料品质优良，适当添加各种维生素，减少疾病的发生，减少损失。