利用SSR分子标记研究白菜类亚种资源的遗传多样性

李光光　黄红弟　张华　郑岩松　李荣华

摘 要 为研究几种白菜类亚种资源的演变过程，利用白菜SSR引物对94份白菜类亚种种质资源进行遗传多样性分析。结果表明，19对SSR引物扩增出137个条带，平均每对引物可扩增出7.16个；多态性位点百分率（P）、基因杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）、Shannon-Wiener指数（H）和多态信息含量（PIC）的均值分别为：99.9%、0.897、11.598、2.454、0.886，除P值外，4个指标间相关性极显著；94份白菜类亚种种质资源的UPGMA聚类结果表明：在遗传相似系数为0.58时实验材料分为3类，多数地方种菜心与小白菜亲缘关系更近。白菜SSR引物对大（小）白菜基因组具有较好的多态性、红菜苔次之、野生芥菜最低。

关键词 白菜类亚种资源；SSR；遗传多样性；亲缘关系

中图分类号 S330 文献标识码 A

Abstract In order to analyze the evolution of Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]resource， a total of 94 Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]materials were used to assess the genetic diversity. The results showed that， nineteen cabbage SSR primers combinations amplified 137 alleles， 7.16 loci on average for each pair of primers. The average of polymorphism loci percentage（P）， genetic heterozygosity（He）， effective number of alleles（Ne）， Shannon-Wiener index（H）and polymorphism information content（PIC）was 99.9%， 0.897， 11.598， 2.454， 0.886， respectively， and there were extremely significant correlation among them except P value. 94 Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]materials were clustered into three groups by UPGMA when GSC was 0.58， much of local Chinese cabbage was closer relationships with pakchoi. The order of genome amplification polymorphism by Chinese cabbage SSR primers was（small）cabbage， red bolt second lowest and wild mustard.

Key words Chinese cabbage[ssp. chinensis（L.）Makino]resource； SSR； genetic diversity； genetic relationship

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.021

蕓薹属白菜类蔬菜[Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. communis Tsen et Lee]为A基因组，除了大白菜外，其亚种有5个变种：普通白菜变种（var. communis Tsen et Lee）、乌塌菜变种（var. rosularis Tsen et Lee）、菜薹变种（var. utilize Tsen et Lee）、紫菜薹变种（var. purpurea Bailey）及薹菜变种（var. tai-tsai Hort），经过自然及人工选择形成了类型丰富的群体。普通白菜变种中的不结球白菜（Brassica rapa L. ssp. chinensis Makino）及菜薹变种中的菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）多数起源于华南地区，具有生长期短、适应好及营养好等特点，经过长期的种植及选择，在华南地区产生了不同的地方种资源及商品种材料。相关研究对一些白菜类资源已进行了分类及遗传多样性研究，但由于白菜类作物属于异花授粉类型，较高的异交率及地方长期选择后，逐渐在形态、生长发育等方面出现较为复杂的变异，不利于该类资源的创新利用。

种质资源是遗传育种选育的材料来源，对农业生产及品种创新具有重要意义。白菜类蔬菜作物的品种鉴定、遗传多样性及亲缘关系的鉴定报导多是利用RAPD、SRAP、ISSR、SSR、MFLP等[1-5]，由于SSR为共显性分子标记技术，操作简单，重复性好，可随机、均匀的分布在扩增的基因组内，被普遍用于遗传图谱的构建、基因定位、遗传多样性和指纹谱图的绘制[5]。根据基因组遗传信息开发出的SSR引物，对于属内作物，还具有一定的通用性，有利于同属的作物的资源评价分析，并对研究属内群体的性状演化起到借鉴作用。

目前分子标记技术多是针对白菜类作物的商品种进行研究，对群体内的自交系本身及自交系与商品种之间的演变研究还未见报道。本试验利用开发出的19对大白菜基因组SSR引物，对白菜类亚种资源群体内结构特点及遗传多样性进行分析，以期为白菜类亚种作物进行育种材料的遗传改良、基因库的构建提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

94份试验材料（表1）均为菜心课题组改良的中间材料及在种子市场购买的商品种和田间收集的地方种，所有材料均种植在广州市农业科学研究院花都试验基地，常规田间管理。

1.2 方法

改良CTAB 法提取试验材料嫩叶中的DNA，PCR反应体系组成及扩增过程按照张婉等[6]方法，银染检测6%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。0-1记录条带的有无，计算各引物下的多态性百分率，NTSYS-pc 2.10e软件分析0-1矩阵，通过UPGMA法生成聚类图，构建白菜类亚种资源的遗传多样性。

按照张超等[7]方法计算遗传多样性相关指标，获得杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）、Shannon-Wiener指数（H）、多态性位点百分率（P）、多态信息含量（PIC）等相关信息。

2 结果与分析

2.1 白菜SSR引物多态性分析

利用19对白菜SSR引物对94份白菜类蔬菜基因组DNA进行扩增，获得了137个条带，多态性条带占总条带的99.27%。每个引物可扩增得到多态性条带3～12个、平均7.16个，说明94份参试材料的遗传信息较多，见图1（A-B）。

2.2 遗传多样性指标分析

试验材料的多态性位点百分率（P）为97.5%～100%，多态性>50%，表明19对白菜基因组SSR引物能扩增出丰富的遗传信息；基因杂合度（He）均值为0.897，变化范围为0.729～0.948；有效等位基因数（Ne）为11.598，变化范围为3.694～19.354；Shannon-Wiener指数（H）均值为2.454，变化范围为1.409～3.010；多态信息含量（PIC）均值为0.886，变化范围为0.680～0.946，这些遗传多样性指标均表明参试白菜类蔬菜群体的遗传多样性较强（表2）。

遗传多样性指标相关性分析表明（表3），多态性位点百分率P与其它指标之间无任何显著性相关，说明P值可以描述引物扩增的多态性，但不能对试验群体的遗传信息丰富度进行說明；而扩增带数、He、Ne、H相关性非常显著，这些指标可以对白菜类蔬菜种质资源的多样性进行描述。

2.3 SSR标记的遗传相似性分析

0-1矩阵的相似性分析结果（图2）表明，94份白菜类蔬菜遗传相似性系数为0.321～0.927，平均相似性系数为0.624、基本上与遗传系数的跨度距离相当；遗传系数0.50～0.75的范围内包含了86.02%的白菜类蔬菜，说明这些蔬菜亲缘关系较近，可以进行种内/间杂交来扩大种质资源的利用效率。

2.4 白菜类蔬菜的聚类分析

利用UPGMA对试验材料的遗传相似系数进行聚类，结果（图3）表明，在遗传相似系数为（GSC）0.58时分为3类。第Ⅰ类中包括群体ⅰ的小白菜C63（563小白菜）和C64（甜脆小白菜）相似性系数为0.766，说明两者多数性状相同，可能具有相同的亲本来源；群体ⅱ有小白菜、红菜苔及大白菜多个类型，说明白菜基因组SSR引物在这个群体中具有一定的遗传信息基础；群体ⅲ为地方种菜心类型（如C13连州菜心、C22增城一号迟菜心），说明这些材料起源于小白菜类，而遗传信息比小白菜类较少，可能是人工选择导致性状改变。

第Ⅱ类群体聚类先后为小白菜、红菜苔及野生芥菜，说明这几个材料的基因组所携带的保守信息有数量上的差异，选用的SSR引物对小白菜基因组具有较好的多态性、红菜苔次之、野生芥菜最少。第Ⅲ类有大白菜、小白菜、菜心、红菜苔及乌塌菜，与C20（桂林卷叶甜脆）较近的C85（矮脚束腰青江白）、C86（矮脚奶白菜）聚在一起，说明地方种菜心具有的遗传信息较多，且起源于小白菜，而地方种菜心C21（十月柳-4-2-2）即使经过低代自交仍然与小白菜C79（白王白菜）、C80（玉兔黑叶白）聚在一起；具有相同亲本的C24（迟2-1-4-2-2）与C32（迟2-1-4-1-2-2-2），C23（迟4-1-3-5）、C33（迟4-1-3-1-6-3-1-2）与C54（迟4-1-3-5-2-3-2）等并没有聚在一起，表明菜心的变异性较高，人工选择会产生明显的遗传信息缺失；商品种的C11（中南尖叶甜）与C12（金船尖叶甜）、C14（尖叶菜心50天）与C15（4560菜心）、C6（穗美60 d）与C7（穗美碧绿甜）遗传相似性非常接近，说明这些品种有相同亲本来源，或者本质上即为相同的品种而名称不同；另外其他商品种菜心及育种中间材料较为分散，与大（小）白菜都有聚类，说明经过人工改良的菜心遗传信息较为复杂。

3 讨论

3.1 白菜SSR引物在白菜类蔬菜基因组的扩增应用

相对于经济作物，白菜类蔬菜SSR引物标记基本上来源于大白菜和小白菜（普通白菜变种），而近缘物种的引物在同属、甚至种间（内）具有一定的通用性，可用来进行遗传多样性分析。不结球白菜SSR引物在大白菜、四倍体白菜、乌塌菜、芥菜等蔬菜的通用性扩增率均在63%以上[8]；34对大白菜SSR引物在6个白菜（包括大白菜、小白菜、菜心等）品系中有效扩增率为82.35%，在甘蓝、油菜和萝卜中的成功扩增率分别为85.71%、100%和77.78%[9]。这与本实验利用19对白菜基因组SSR引物对白菜类蔬菜及野生芥菜的均可获得扩增条带（通用性扩增率为100%）的结果基本一致；而扩增条带数量不一，说明白菜类亚种基因组间存在一定的保守信息。

3.2 白菜类蔬菜的遗传多样性分析

对94份白菜类蔬菜基因组进行SSR扩增，获得平均多态性位点百分率为99.9%，且遗传相似性系数为0.321～0.927，群体内的遗传差异很大，说明试验群体携带有很高的遗传多样性信息。6个遗传多样性指数方差分析表明：除了多态性位点百分率P外，扩增带数、He、Ne、H相关性非常显著，这与李光光等[10]结果基本一致，这说明P可以描述引物的遗传信息，但却不能对试验群体进行准确描述。试验得到的Ne与扩增条带数相差0.394～9.354，相差较大，表明群体遗传变异较大[11-12]；基因杂合度（He）较大说明遗传变异的大、选择潜力强[13]；多态信息含量（PIC）>0.5时，表明群体有高度多态性位点[14-15]；Shannon-Wiener指数（H）越大，对于其中繁衍和保护物种多样性的能力越强[16]。He为0.729～0.948、PIC为 0.680～0.946、H为1.409～3.010，表明本试验群体内所选用的材料变异幅度较大、类型多样，且可用于选择的潜力较高、群体多样性很强，有利于资源的创新利用。

3.3 白菜类亚种资源的聚类分析

白菜类蔬菜类型较多，利用分子标记对其群体进行关联作图来分析其结构组成[17]，是资源利用的重要步骤之一。94份白菜类亚种资源存在遗传相似性系数0.35以下的材料，说明群体的类型组成较为丰富，有利于白菜类亚种蔬菜资源的创新利用。

第Ⅰ类中的群体ⅲ基本上将地方种菜心都聚在一起，说明来源于白菜基因组的SSR引物能较好的反映群体的遗传组成，地方种菜心的起源更接近于小白菜，这与地方种增城迟菜心更接近于紫菜薹类型乔燕春等[18]的结果不尽一致，可能是其表型性状的调查标准偏差影响了总体的聚类分析。第Ⅱ类群体的聚类顺序说明同属的SSR引物能对亲缘关系较近的材料基因组扩增出的遗传信息较多，亚种变种次之，属内扩增的最少。第Ⅲ类基本上将试验材料类型都聚在一起，其中属于华南地方种菜心与小白菜聚在一起，与第Ⅰ类中的群体ⅲ上的聚类结果一致，说明地方种更趋向于普通白菜，经低代自交后，遗传信息变化不大；而经多代人工自交选育的商品种菜心，与大（小）白菜聚类没有明顯的规律，说明商品种菜心的遗传关系较为复杂。

野生二倍体芸薹属B. rapa（2n=20，AA）经自然选择及人工驯化栽培形成了资源类型丰富的白菜类作物，一般认为先形成不结球的小白菜，再经过长期的选择更形成了塌菜等5大形态不同的变种[19]；另外野生芥菜（B. juncea）也是由野生B. rapa演化为而来的异源四倍体次生种，这些作物在形态上的差异较大，但由于具有较高的异交率，会使遗传信息在一定程度上得到保留。本实验包括大（小）白菜、菜心、红菜薹、乌塌菜、野生芥菜5个类型的芸薹属材料，94份白菜类蔬菜聚为3大类，各类组成没有明显的群体结构，说明白菜类亚种资源在自然及人工作用下，可以较为容易的实现遗传物质的转移，为扩大性状的遗传改良提供了丰富的资源基础。

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