福建省53份茶树种质资源遗传多样性ISSR分析

朱晨　张舒婷　常笑君　王仲　许长同　张梓浩　林玉玲　赖钟雄　郭玉琼

摘 要 利用ISSR分子标记技术对福建省7个地区的茶树品种进行遗传多样性和遗传结构的分析。筛选出的12条引物共扩增出97条条带，其中多态性条带有92条，多态性谱带百分率为94.84%；53份供试材料可划分为5大类（GS=0.71），遗传距离介于0.66～0.99之间；Nei基因多样性指数为0.224，Shannon's信息指数为0.368，不同地区茶树的遗传多样性参数差异较大，其中宁德福安地区最高，福州鼓山地区最低；总变异系数为0.332，地区内个体间遗传多样性为0.154，而地区间为0.231，福州地区与其他地区之间的相似性较弱；研究认为，福建省茶树遗传多样性丰富，不同地区茶树存在高频率遗传变异，而缺乏遗传信息交流是造成福州地区遗传多样性较低的可能因素。

关键词 茶树；种质资源；ISSR；遗传多样性

中图分类号 S571.1 文献标识码 A

Abstract The genetic diversity and genetic structure of tea plant in seven regions of Fujian Province were examined by ISSR.The results showed that， 97 bands were amplified with 12 ISSR primers， the polymorphic bands of which were 92， and their polymorphism percentage was 94.84%. 53 tea plant resources were divided into 5 groups（GS=0.71）. The range of genetic distance was between 0.66～0.99. The Neis genetic distance was 0.224， the Shannons information index was 0.368， and the genetic diversity in different regions of tea plant had significant？difference. Fu'an in Ningde was the highest when the Gushan Mountain in Fuzhou got the lowest similarity with the others. The coefficient of gene variation was 0.332. The values of genetic diversity in and between the regions was 0.154 and 0.231， respectively.The Fuzhou area got low similarity with the others. The results indicated that， there was high genetic diversity of tea plant in Fujian Province， which had high frequency of heritable variation in different regions. The insufficiency of genetic information flow might be the main fact of the genetic diversity in Fuzhou area.

Key words Camellia sinensis； germplasm resources； ISSR； genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.07.019

茶树（Camellia sinensis）属于山茶科山茶属，是多年生、木本、常绿植物，福建省是茶叶的主产地，栽培历史悠久，茶树种质资源丰富[1]。近年来随着新品种选育研究和示范推广工作的不断深入，越来越多的优良茶树新品种对茶区产量和品质的提升起到了推动作用[2]，但由于异花授粉和近交衰退的影响，造成选育的新品种遗传基础单一，新品种的优良性状不能较好的遗传保持，子代的遗传性状良莠不齐，不利于茶产业的持续稳定发展。同时传统的育种方法选育周期长，亲本选择范围有限，大多只考虑表型性状因素[3]，限制了茶树种质资源的研究和新品种的選育。随着分子生物学的发展，基于基因组DNA水平的分子标记技术在植物遗传连锁图谱构建、指纹图谱的绘制和品种鉴定、种质资源的遗传多样性研究以及基因标记和定位等方面的应用越来越广泛，这为茶树优良品种的选育开拓了新的思路。因此利用分子标记技术对福建省现有的茶树种质资源进行遗传多样性、亲缘关系和遗传性状进行分析、鉴定和分类，可以为亲本的选配提供科学依据，降低选育的难度，推进良种培育的进程[4-5]。

ISSR分子标记技术是一种利用简单序列重复的寡核苷酸引物进行PCR扩增，通过检测不同物种SSR位点间的序列长度来判断其多态性[6]。与AFLP、RAPD和SSR等其他分子标记技术相比，ISSR技术多态性丰富，稳定性强，操作简单，相对成本较低，适用于亲缘关系较近的材料[7-10]。同时ISSR分子标记技术在茶树及其他植物基因型鉴定和亲缘关系的分析利用等方面已有相关报道[11-18]，而有关福建省茶树种质资源遗传多样性的综合分析还鲜有报道。

本研究采用ISSR分子标记技术结合生物信息学分析对福建省内不同地区的53份茶树种质资源进行亲缘关系的探究和遗传多样性的分析，以期为有效地鉴别福建省茶山林海中未收集保存的珍稀茶树种质资源、保护和利用已培育的优良茶树新品种提供新的技术手段；更为今后福建省茶树核心种质库建立以及杂交育种亲本选配提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

53份供试材料采自福建省7个地区（表1）。采后茶树叶片置于密封袋中，经液氮处理后放置-80 ℃冰箱保存。

1.2 试验方法

茶树基因组DNA提取参照唐玉海等[19]的改良CTAB法。ISSR-PCR扩增体系优化参照林郑和等[20]的方法。PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s；退火温度（根据不同引物而定）退火30 s；72 ℃延伸2 min，37个循环后72℃继续延伸10 min。

1.3 数据处理

电泳图上同一位点无条带和虚弱条带统一标记为0，有明显条带的标记为1，并建立原始二元數据矩阵[21]，计算每个引物的多态性比率（多态性带数/总带数）。利用NTsys2.0、Popgene32和STRUCTURE2.3.4软件分别进行遗传距离聚类分析[22-23]、遗传多样性参数计算和遗传结构分析[24]。

2 结果与分析

2.1 ISSR引物筛选与扩增结果多态性分析

根据条带清晰程度和多态性程度来筛选引物并确定最适退火温度，最终筛选出12条引物及其最适退火温度，各个引物的最佳退火温度一般会略高于或低于引物理论退火温度。

用所筛选出来的12条引物对53份供试材料进行扩增，部分引物扩增结果如图1所示，共扩增出97条清晰可见的条带，其中92条是多态性条带，每条引物平均扩增8.08个条带和7.67个多态性条带，多态性百分率达到94.84%（表2），其中引物UBC844的多态性最弱，仅为80%，而引物UBC811、UBC818、UBC827、UBC840、UBC854、UBC856、UBC857和UBC895的多态性最好，多态性百分率均到达100%。同时不同引物扩增结果也不相同，引物UBC811、UBC816、UBC856和UBC857扩增的条带明显多于引物UBC818和UBC895。

2.2 福建省茶树遗传距离分析

在图2中以遗传距离GS=0.71为标准，将供试材料划分为5大类（表3），其中A类共有39个茶树品种，以GS=0.74为标准又可以把A类分为4个组，其中Ⅰ组的金牡丹和金观音之间的遗传相似性系数高达0.99；罗源飞竹外坂和罗源西洋1号的相似性系数也高达0.90。由于金牡丹和金观音的选育亲本相同，因此两者遗传背景相似；罗源飞竹外坂和罗源西洋1号同处于罗源县飞竹镇，生长环境和气候相似，因此遗传距离相近。Ⅱ组主要有武夷山地区的大红袍、水仙、肉桂等品种。采自闽侯方山的5个品种聚类为Ⅲ组；B类只有福安菜茶1个茶树品种，可能与福安菜茶品种的不确定性和遗传背景的复杂性有关。C类分别是早春毫、白云特早、矮脚乌龙6号和杂交1号；D类是采自建瓯的矮脚乌龙1号、2号和5号；黄旦、黄观音和黄玫瑰等都归入E类。南平建瓯的矮脚乌龙1～6号分别聚类到A、C、D类中，是由于建瓯矮脚乌龙1～6号采自建瓯东峰镇百年矮脚乌龙种植园，其遗传背景存在差异。

2.3 福建省茶树遗传多样性分析

采用Popgene32对福建省7个地区的茶树进行遗传多样性分析，其等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Nei基因多样性参数（H）、Shannon′s信息指数（I）、多态性位点数（N.P.B）和多态位点百分率（PPB）等参数分析结果显示（表4），不同地区茶树的Nei基因多样性指数（H）介于0.099～0.207，平均为0.154；Shannon′s信息指数（I）介于0.148～0.324，平均为0.242；可见，福建省茶树的遗传多样性水平较高。进一步依据不同地区的基因多样性指数从大到小排列发现，不同地区间茶树的遗传多样性水平存在明显差异，分别为南平建瓯>宁德福安>南平武夷山>闽侯方山>福州罗源>福州鼓山>福州永泰。7个地区茶树的多态性位点数介于24～88，多态性位点百分率介于22.49%～86.80%，总多态性位点百分率达到95.58%。其中，南平建瓯、宁德福安和南平武夷山地区的茶树的多态性位点数较高，而福州鼓山和福州永泰的多态性位点数最低。

2.4 福建省茶树遗传分化分析

福建省茶树总遗传分化系数（Gst）为0.332，即66.80%的遗传分化来源于不同地区茶树内部，而33.20%的遗传分化来源于地区之间，可见福建省茶树的遗传分化或遗传变异主要来源于地区内部。进一步分析发现，基因流（Nm）为1.007，略大于1.0，表明不同地区茶树之间遗传漂移阻碍较小，存在一定频率的遗传信息交流。而在地区内部和地区间茶树分析中，地区内部茶树间的遗传多样性（Hs）仅为0.154，地区间茶树的遗传多样性（Ht）为0.231，结合各项遗传分化参数推断，福建省茶树遗传多样性主要由于不同地区茶树的遗传分化或变异水平所导致的，与茶树生长环境差异可能存在较大关系，这对鉴别珍贵茶树种质资源提供了新的参考依据。

进一步分析遗传相似系数（表5）发现，福州罗源和宁德福安茶树的亲缘关系最近，遗传相似度达到0.981，推测可能与这两个地区距离较近且生态环境较一致有关；福州鼓山与福州永泰茶树的亲缘关系最远，仅为0.763，可能由二地之间的局部环境差异导致。

2.5 福建省茶树遗传结构分析

采用STRUCTURE 2.3.4软件对福建省茶树53份样品进行遗传结构分析发现，当K=3时，能取得最大的△K值和稳定的lnP（K）值。因此，福建省7个地区的茶树可分为3大类（图3），群体Ⅰ主要由南平建瓯、福州罗源和宁德福安的大部分品种组成；群体Ⅱ主要由福州鼓山、福州罗源和宁德福安的部分品种组成；群体Ⅲ包含南平武夷山、福州永泰、闽侯方山和宁德福安的部分品种。在遗传结构上进一步验证不同地区茶树之间可能存在较高频率的遗传信息交流。值得注意的是，霞浦元宵绿、泮野2号和矮脚乌龙3号在概率上无法和其他样品一样准确归属到具体某一个类别中，由此可见福建省茶树遗传背景确实相对复杂。

进一步分析发现，福建省茶树模型聚类的后验概率Q值介于0.468～0.975之间，南平武夷山、福州永泰、闽侯方山和南平建瓯地区的概率值几乎都大于0.7，且87.5%的茶树个体分布Q值大于0.9，说明这4个地区茶树个体之间的遗传信息交流较为有限。而福州鼓山、福州罗源和宁德福安地区的Q值介于0.468～0.597之间，其中大于0.9的茶树个体仅占65.51%，与其他4个地区相比，这3个地区的茶树可能存在更复杂的遗传背景，具有更丰富的遗传多样性，因此这些地区的茶树种质资源具有更高的开发利用价值。

3 讨论

3.1 福建省茶树的遗传多样性丰富

利用筛选后的12条引物对福建省茶树53份供试材料进行了ISSR分析，由于样品既有来自同一地区的不同品种，也有来自不同地区的相同品种，还有同一地区的相同品种，样品间的遗传背景较为复杂。原产于南平武夷山地区而引种至宁德福安地区的武夷菜茶1号和2号与宁德福安地区其他茶树品种划分在同一组别，可能是经过不断的引种驯化和人工选育，以及品种间自然杂交，或是由于环境因素的影响而表现出较近的亲缘关系[25]。综合STRUCTURE分类结果与福建各地气候环境进行分析，福州地区处沿海地带，受海洋气流影响，终年温暖湿润，阳光充足，霜少无雪，因此茶树主要以提高抗虫病能力为主；福安、建瓯和罗源地区茶树多分布于内陆山区，冬季易受南下冷空气影响，主要以增强抗寒性变异为主；而南平武夷山和闽侯方山为山地气候类型，具有明显的垂直分布区域性特点，影响因素更为复杂。因此，福建茶树品种的丰富性、福建各地气候环境的多样性和茶树的引种驯化和人工选育共同造就了福建省茶树丰富的遗传多样性。

3.2 福建省不同地区茶树存在高频率遗传变异

地区内和地区间遗传变异信息是制定物种保护策略的重要参考依据[26]。物种的遗传多样性水平影响因素除了地区间的遗传信息交流，还可能来源于环境和基因型引起的不同地区个体之间的特殊变异。Roy[27]，Liu[28]和Joshi等[29]研究均发现茶树不同地区的遗传分化水平高于地区内个体的遗传分化水平，即茶树的遗传变异主要来源于地区之间。而本试验研究发现，不仅地区之间，同一地区内茶树的遗传变异也会引起地区内部的个体间差异，模型聚类结果也表明福建省茶树遗传结构并不按照地区差异进行划分。可见，自然选择或地理环境对不同地区茶树变异的影响具有一定的平行性，而且这种生活环境的异质化所造成的不同地区的差异是茶树主要的变异来源，而作为亚类群，不同品种在其中的影响力较弱。此外，这种地区间高水平的遗传变异也可能与较高的基因流有关[30-31]。总而言之，受外界条件干扰，福建省不同地区茶树存在高频率遗传变异，而这种干扰在品种间的差别可能较小。

3.3 部分地区茶树种质资源亟需重点保护

遗传多样性分析是植物新品种选育的基础，而不同物种濒危类型所表现出的遗传多样性程度也不同[32-33]。福建省茶树总Nei遗传多样性参数达到0.224，高于Wachira[34]报道的日本（0.169）、越南（0.194）、斯里兰卡（0.199）和肯尼亚（0.201）等国茶树的平均遗传多样性水平，福建省茶树具有更高的遗传多样性。此外，Irwin[35]研究发现，福建省茶树遗传漂移阻碍相对较小，存在较高频率遗传信息交流。然而不同地区遗传多样性差异较显著，从大到小排列为南平建瓯>宁德福安>南平武夷山>闽侯方山>福州罗源>福州鼓山>福州永泰，且福州罗源、鼓山和永泰地区与其他地区的遗传相似度较低。结合福州地区茶树分布实地调查推断，遗传多样性的丰富与否可能造成不同茶树品种之间生存、繁殖和适应能力等方面差异从而影响茶树的空间结构分布。随着茶树无性系良种的不断推广，地区特色茶树品种已逐步被相对单一的无性系良种取代，从而导致地区内部的品种多样性逐渐丧失。因此，城市化高速发展的福州地区是福建省茶树种质资源保护的重点，注重地方品种资源的收集、保存和保护，防止遗传多样性的进一步丢失。

今后可利用ISSR分子标记技术，在全省乃至全国范围内收集茶树种质资源，建立省级和国家级优良茶树品种的ISSR指纹图谱，可以对现有珍稀茶树种质资源进行有效的鉴别和保护，为优良茶树品种的选育以及全国性的茶树种质资源库的建立提供科学依据[36]。

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