Asp53与东亚钳蝎神经毒素BmK9的镇痛活性相关

王月秋++李珊珊++曾红++张景海

【摘 要】大多数来自东亚钳蝎的具有镇痛活性的多肽类神经毒素53位均为天冬氨酸，但目前尚无这个残基在毒素镇痛活性中作用的报道。本研究采用突变分析的方法考察Asp53与东亚钳蝎神经毒素BmK9镇痛活性的关联，构建突变体D53A，D53E，D53N和D53K，小鼠扭体法测定重组BmK9及其突变体的镇痛活性。结果显示除D53E这一保守取代外，其余三个突变都导致了镇痛活性的显著降低。目前的研究结果提示，Asp53与东亚钳蝎神经毒素BmK9的镇痛活性相关，其侧链羧基发挥了关键作用。

【关键词】Asp53 BmK9 镇痛活性 定点突变 结构功能关系

东亚钳蝎（BmK）作为传统中药用于治疗多种慢性疼痛已有几千年的历史，迄今为止，发现了十余种多肽类的东亚钳蝎毒素具有镇痛活性[1-5]。它们都是60-76个氨基酸构成的单链多肽，属于蝎长链神经毒素，具有共同的结构核心[6]。这些毒素结构的相似性是否意味着它们有着共同的镇痛活性相关位点值得关注，研究者通过基因突变分析的方法对几个毒素的结构镇痛活性关系进行了考察，揭示了几个位点与镇痛活性的关联[5，7-11]。最近，邓理等报道了两个保守的酪氨酸（Tyr5 和Tyr42） 在BmK AGP-SYPU1[12]镇痛活性中的作用，但有关东亚钳蝎毒素镇痛活性相关位点的信息还非常有限。

BmK9是从东亚钳蝎蝎毒获得的65个氨基酸残基构成的单链镇痛活性肽[5]，编码BmK9前体（GenBank ID： DQ981785）的全长cDNA已被克隆。BmK9的53位是一个天冬氨酸，在大多数的东亚钳蝎镇痛肽中该位点都被天冬氨酸占据（图1所示），但是目前还没有Asp53在这类毒素镇痛活性中作用的研究。本研究对BmK9在53位进行定点突变以考察53位天冬氨酸在镇痛活性中的作用。基于获得的实验结果，讨论了Asp53在BmK9镇痛活性中的重要性。

通过ClustalW2进行比对[13]（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）。在序列中插入空隙（用“-”表示）以获得最大相似性，氨基酸残基的编号及序列一致性以BmK9为依据，53位残基用箭头指示。基因库序列号如下：BmK9 （DQ981785），BmK AngM1 （AF164203），BmK AGAP（AF464898），BmK AGP-SYPU1 （GU726488），BmK AGP-SYPU2 （GU726489），BmK dITAP3 （AF064821）[14]，BmK IT2 （UniProtKB/Swiss-Prot： P68727）[15]，BmK IT-AP （AF156171），BmK AS （AF079060）和BmK AS1 （AF079061）[16]。

1 材料与方法

1.1 材料

质粒pSYPU-BmK9和pSYPU由实验室构建，用于表达的宿主菌BL21（λDE3）购于上海生工生物工程技术服务有限公司；限制性内切酶，T4 DNA 连接酶，Taq DNA聚合酶和引物来自南京金斯瑞生物工程技术服务有限公司；金属离子螯合亲和层析及阳离子交换层析介质购于瑞典Pharmacia公司；SPF级昆明种小白鼠由北京华富康生物科学公司（NO： SCXK-[京]2009-004，北京，中国）提供。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的构建

根据BmK9的序列设计4个下游引物：D53A，5′-CGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT AGC GGG CA-3′； D53N，5′-CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT ATT GGG CA-3′；D53E，5′-CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT TTC GGG CA-3′；D53K，5′ -CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT CTT GGG CA-3′。以质粒pSYPU-BmK9为模板，T7引物为上游引物，D53A，D53N，D53E和D53K分别为下游引物进行PCR扩增。产物酶切后克隆至载体pSYPU，热转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取阳性克隆菌落PCR验证后测序。

1.2.2 诱导表达及分离纯化

将含有重组质粒pSYPU-BmK9，pSYPU-BmK9/D53A，pSYPU-BmK9/D53N pSYPU-BmK9/D53E 和 pSYPU-BmK9/D53K 的大肠杆菌接种于含 50 mg·L-1 卡那霉素的LB培养基中培养，异丙基-β-D -硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导目的蛋白表达。收集菌体超声破碎后离心，上清液经金属离子螯合的亲和层析柱（Chelating Sepharose Fast Flow， 1.0 cm×6.5 cm）进行初步纯化，以pH值3.0的0.1 mol·L-1 PBS洗脱目的蛋白。收集目的蛋白，经SP Sepharose Fast Flow柱（1.0 cm×20 cm）进一步纯化，用0～1.0 mol·L-1NaCl水溶液（含50 mmol·L-1PBS，pH值6.6）梯度洗脱目的蛋白。SDS-PAGE 分析重组蛋白纯度，考马斯亮蓝R-250 染色[8]。

1.2.3 鎮痛活性

小鼠醋酸扭体法考察镇痛活性，用生理盐水配制合适浓度的重组蛋白溶液进行活性检测。取18～20g昆明种 SPF 级小鼠，雌雄各半，随机分组，每组10只，按 0.5mg/kg 的剂量尾静脉给药，20min 后按 0.2ml/20g 体重腹腔注射 0.6% 醋酸引起内脏痛，5min 后记录小鼠 10min 内的扭体次数。以重组BmK9 为阳性对照，生理盐水为阴性对照，按照下述公式计算各个给药组的扭体反应抑制率。

2 結果

2.1 表达载体的构建

以质粒 pSYPU-BmK9为模板，T7引物为上游引物，D53A，D53N，D53E和D53K分别为下游引物进行PCR扩增，PCR产物克隆至表达载体pSYPU，构建成功的表达质粒分别热转化大肠杆菌 BL21（λDE3）细胞，挑取重组子验证。DNA序列测定显示 BmK9 及其突变体基因均正确克隆。

2.2 诱导表达及分离纯化

IPTG诱导后，重组蛋白主要以可溶性形式表达。两步层析法纯化重组蛋白后，15%SDS-PAGE分析重组蛋白（以突变体D53A为例）的纯度，结果见图2所示，重组蛋白的纯度基本达到电泳纯。

泳道1，两步层析纯化的重组BmK9；泳道2，两步层析纯化的突变体D53A；泳道M，低分子量蛋白标准品

2.3 镇痛活性

如表1所示，与生理盐水组相比，重组BmK9及其突变体均呈现出明显的镇痛效果（p<0.05）。与重组BmK9相比，突变体D53A，D53N和D53K的镇痛活性均显著降低，而突变体D53E与重组BmK9的镇痛活性无明显差别。

3 讨论

大多数来自东亚钳蝎的具有镇痛活性的多肽类神经毒素的53位都是天冬氨酸，Asp53在这类毒素镇痛活性中的作用有待鉴定，而定点突变是阐明特定位点氨基酸残基作用的一种有效途径。用非极性的甲基（CH3）取代天然毒素的羧甲基（CH2COOH），突变体D53A的镇痛活性显著降低（下降42%），提示Asp53与BmK9的镇痛活性相关，其侧链羧基发挥了关键作用。极性不带电荷的天冬酰胺取代天冬氨酸的突变D53N也导致镇痛活性的显著降低（下降50%），提示Asp53的侧链羧基是通过净电作用在镇痛活性中发挥作用。同种电荷取代的突变体D53E的镇痛活性与BmK9的镇痛活性几乎相同，而相反电荷取代的突变体D53K的镇痛活性显著降低（下降34%），则进一步证实了53位的侧链负电荷对毒素镇痛活性的重要性。

本研究结果提示东亚钳蝎神经毒素BmK9的Asp53通过其侧链羧基的净电作用在镇痛活性中发挥关键作用，这一结果为蝎毒素结构镇痛活性关系研究提供了进一步的信息。

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