检测阿尔茨海默病患者血浆肿瘤坏死因子转化酶活性的方法研究

王维生　李桂芹　白琳

【摘要】目的 分析阿尔茨海默症病患者血浆中肿瘤坏死因子转化酶活性的方式。方法 分析经临床诊断为阿尔茨海默症病患者血液1 mL，经过抗凝处理之后，在离心作用下获取血浆。分别取出2.5 μL，5 μL，7.5 μL和10 μL血浆并放置于96孔板中，从而在加入定量反应液与酶底物后，采用荧光酶标仪观察血浆内部的TACE在37℃下与底物酶反映的速度。结果 通过对比7.5 μL的血浆反应体系及其他反应体系，发现TACE的酶反映速度最快。结论 检测阿尔茨海默病患者血浆内部的TACE活性最适宜的血浆剂量是7.5 μL。

【关键词】肿瘤坏死因子转化酶；阿尔茨海默病；酶反应速度

【中图分类号】R592 【文献标识码】B 【文章编号】ISSN.2095-6681.2016.30.0.02

老年痴呆症属于一种大脑器质性损害造成的脑部功能障碍，现代医学研究证实，在老年痴呆病人中发现脑内有明显炎症与自主免疫反应[1]，肿瘤坏死因子属于一种重要的细胞因子，主要参与免疫及炎性反应，通过细胞膜上的受体发挥出实际作用[2]，TNFR经TACE酶切后，会释放可溶性的TNFR（sTNFR）[3]。在AD中，TACE可以作为临床上诊断AD的一个生物学指标。在本实验中，选用了不同剂量的血浆参与酶底物反应，从而获取到相关曲线图，根据每一条曲线相同时间段内的斜率，证实酶反应速度，经过对比分析，检测出AD患者血浆中的TACE活性的提供最佳血浆剂量。

1 材料与方法

1.1 血浆收集

在清晨，需要保持空腹的状态，并且进行静脉穿刺抽取静脉血并放置于EDTA的抗凝管内部，从而适当的添加蛋白酶抑制剂，在离心之后，吸取上层血并置于EP管内部，保存在-80℃，尽量避免出现反复冻融的情况。

1.2 实验试剂

酶底物：R&D system公司产品。Tris-HCL：索莱宝公司产品。氯化锌：天津恒兴化学试剂有限公司产品。二甲基亚砜（DMSO）：中昊生物公司产品。AEBSF：Roche公司产品。

1.3 实验仪器

酶标仪（SpectraMax M5）：香港分子仪器有限公司，中国。

1.4 反应原理及检测步骤

分别取87.5、85、82.5、80 μL的血浆稀释液，放置于96孔板中。针对每一个孔分别加入2.5、5、7.5、10 μL的AD血浆。保证在避光状态下，每个孔都需要加入10 μL的酶底物，轻轻混匀，立即检测。将酶标仪调至37℃，在320 nm的激发波长、405 nm的发射波长处测定TACE与底物的反应速度，分别得到四条酶反应曲线。在这四条曲线上从同一起点分别取七个数值进行统计分析。

1.5 统计学方法

数据应用GraphPad Prism 5.0统计软件进行分析（One-Way ANOVA）并继以Turkey法进行，以“x±s“表示计量资料，采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

检测血浆中TACE活性的最佳血浆剂量，分别加入不同剂量血浆的酶反应体系之间相比，加入7.5 μL血浆的酶反应曲线斜率最大，与2.5，5.0，10 μL的酶反应曲线斜率相比差异有统计学意义（P<0.05）。见表1，图1。

3 讨 论

在AD中，TACE是参与其病理过程的，TACE能够酶切TNFR，并且释放出可溶性TNFR，当TACE的活性较强时，应该适当的让细胞表达出TNFRI和TNFRII降低，TNFRI表达降低，会导致Aβ的生成量降低；而TNFRII表达降低，却会导致Aβ的生成量增多。

在本实验中，我们将AD患者的血浆与酶底物加在一起，在37℃，激发波长320 nm，发射波长405 nm的状态下，经过分析酶反映曲线，能够发现当加入7.5 μL血浆的时候，酶反映曲线的斜率最大，此时速度也最快。综上所述，临床上检测AD血浆中TACE活性的最佳血浆剂量是7.5 μL。

参考文献

[1] Wyss-Coray T，Mucke L.Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword[J].Neuron，2002，35（3）：419-432.

[2] Wajant H，Pfizenmaier K，Scheurich P.Tumor necrosis factor signaling[J].Cell Death Differ，2003，10（1），45-65.

[3] Reddy P，Slack JL，Davis R，et al.Functional analysis of the domain structure of tumor necrosis factor-alpha converting enzyme[J].J Biol Chem，2000，275（19）：14608-14614.

[4] 馬贵亮，毛伟征，杨 堃，安 岗，岱震波.人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达[J].青岛大学医学院学报，2010，3（1）：189-192，195.

本文编辑：吴宏艳