藏药十五味云鹏散含汞制剂和无汞制剂对免疫低下小鼠免疫功能的影响比较

袁发荣　李先加　普措多杰

[摘要] 目的 研究藏药十五味云鹏散含汞制剂和无汞制剂对免疫低下小鼠免疫功能的影响。 方法 选择90只Balb/c种雌性小鼠，按体重随机分为空白组、模型（环磷酰胺）组、阳性（胸腺肽肠溶片0.01 g/kg）组、十五味云鹏散含汞制剂高、中、低剂量（0.38、0.18、0.09 g/kg）组及无汞制剂高、中、低剂量（0.38、0.18、0.09 g/kg）组，每组各10只；除空白组外，其余各组小鼠腹腔注射环磷酰胺，造成免疫功能低下的动物模型。各给药组于第4天开始灌胃给药，连续给药10 d，空白组和模型组灌胃给予等体积的蒸馏水。在末次给药1 h后，颈椎脱臼处死小鼠，分别测定小鼠的脾脏系数、胸腺系数、血清溶血素水平（HC50）以及二硝基氯苯诱导迟发性变态反应（DTH）发生情况。 结果 与模型组比较，十五味云鹏散含汞制剂高、中剂量组和无汞制剂高、中剂量组均能明显提高免疫低下小鼠脾脏系数、胸腺系数和HC50（P < 0.05）；可改善DTH。 結论 十五味云鹏散含汞制剂和无汞制剂可以增强免疫低下小鼠的免疫功能。

[关键字] 藏药；十五味云鹏散；汞制剂；免疫低下

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0045-04

[Abstract] Objective To study the effect of Tibetan medicine Shiwuwei Yunpeng Powder containing mercury preparations and mercury-free preparations on immune function in immunocompromised mice. Methods 90 Balb/c female mice were randomly divided into blank group， model （cyclophosphamide） group， positive （0.01 g/kg Thymopeptides Enteric-coated Tablets） group and Shiwuwei Yunpeng Powder containing mercury preparations high-dose， middle-dose and low-dose （0.38， 0.18， 0.09 g/kg） group and mercury-free preparations high-dose， middle-dose and low-dose （0.38， 0.18， 0.09 g/kg） group according to their body weights， with 10 mice in each group. In addition to the normal group， the other groups immunocompromised mice models been made by cyclophosphamide intraperitoneal injection. From the fourth day， the mice were taken drug by intragastric administration， continuing 10 days， and the mice in the blank group and the model group were taken equal volume of distilled water. The mice were sacrificed by cervical dislocation 1 hour after the last administration. The spleen index， thymus index， value of hemolysin in serum and dinitrochlorobenzene-induced delayed allergy （DTH） were determinated respectively. Results Compared with the model group， the spleen index， thymus index， HC50 levels in the Shiwuwei Yunpeng Powder containing mercury preparations high-dose， middle-dose group and mercury-free preparations high-dose， middle-dose group were increased （P < 0.05）； and the DTH were improved. Conclusion Shiwuweiyunpeng Powder containing mercury preparations and mercury-free preparations can enhance immune function in immunocompromised mice.

[Key words] Tibetan medicine； Shiwuweiyunpeng Powder； Mercury preparations； Immunocompromised

藏药十五味云鹏散由乳香、决明子、儿茶、黄葵子、川木香、诃子、余甘子、宽筋藤、渣驯、藏菖蒲、麝香、水银炮制品等组成[1]。用于治疗关节红肿疼痛、发痒[2-3]，临床效果显著[4-5]；现代药理研究表明，该药具有祛风湿、抗炎、镇痛作用[6]，但对免疫方面的作用研究尚不完善。该方在临床应用中有2种配方制剂——含汞制剂及无汞制剂[6]。佐太是历代名藏医通过对水银进行特殊炮制加工而得到的具有奇特疗效的制剂，藏医认为经过炮制后单用或配制其他药物就能治疗各种疾病。蒋婀娜等[7]研究发现佐太具有良好的抗惊厥、解热、抗炎、增强免疫力的作用。本实验旨在通过动物实验研究，比较十五味云鹏散含汞制剂和无汞制剂对机体免疫作用影响。

1 材料与方法

1.1 药物

十五味云鹏散，规格：0.7164 g/勺，生产批号：20150305，由青海大学医学院提供；注射用环磷酰胺，规格：0.2 g，生产批号：14121825，江苏盛迪医药有限公司；胸腺肽肠溶片，规格：20 mg/片，生产批号：140403，哈高科白天鹅药业集团有限公司；0.9%氯化钠注射液，规格：250 mL：2.25 g，批号：2414120807，青州尧王制药有限公司。

1.2 试剂

2，4-二硝基氯苯，批号：2015年04月01日，上海中秦化学试剂有限公司；硫化钠，规格：500 g/瓶，生产批号：060320，成都金山化学试剂有限公司；丙酮，规格：500 mL/瓶，生产批号：2006年04月26日，天津市化学试剂六厂；豚鼠血清，规格：100 mL/瓶，生产批号：150526，广州鸿泉生物科技有限公司；20%绵羊红细胞（SRBC），规格：100 mL/瓶，生产批号：20150525，平睿生物科技（北京）有限公司；羧甲基纤维素钠，生产批号：20080399，常州市武进庙桥第二化工有限公司。

1.3 动物

90只Balb/c小鼠，SPF级，雌性，6～8周龄，重量18～22 g，购于中国农业科学院兰州兽医研究所，合格证号：SCXK（甘）2010-0001；实验前在实验室饲养1周，适应环境。室温：20～26℃，相对湿度40%～60%，自然光照，排气扇通风，自由饮食、摄水。

1.4 仪器

电子天平，型号JD1060-2，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；7 mm打孔器；离心机，型号TDL-40B，上海安亭科学仪器厂；电热恒温水浴锅，型号HH-4，国华电器有限公司；紫外可见分光光度计，型号UV-2550，日本岛津。

1.5 方法

90只健康Balb/c种雌性小鼠经适应性喂养1周后，按体重随机分为9组，分别为空白组、模型组（环磷酰胺）、阳性组（胸腺肽肠溶片0.01 g/kg）、十五味云鹏散含汞制剂高、中、低剂量组（0.38、0.18、0.09 g/kg）及无汞制剂高、中、低剂量组（0.38、0.18、0.09 g/kg）组，每组10只。除空白组外，其他各组小鼠在实验前3 d腹腔注射环磷酰胺溶液50 mg/kg 1次，连续3 d，制备免疫功能低下的动物模型，空白组注射等量的生理盐水作对照[8]。第4天各给药组开始灌胃给药，连续给药10 d，给药前各组药物的水溶液经超声器震荡处理（37℃ 30 min），空白组和模型对照组灌胃给予等体积的蒸馏水。

1.6 观察指标

1.6.1 耳廓皮肤迟发性超敏反应 各组小鼠于给药第2天以7%硫化钠溶液涂抹腹部进行脱毛，涂抹腹部脱毛范围为3 cm×3 cm，将5% DNCB丙酮溶液0.05 mL均匀涂布在脱毛区域致敏，于给药第5天强化1次，在第10天末次给药后1 h，将1% DNCB丙酮溶液0.02 mL均匀涂布于小鼠左耳进行攻击，使局部产生水肿，攻击后24 h，颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳片，用打孔器取下直径7 mm的耳片，称重，以左右耳片重量之差作为肿胀度，将其作为迟发性超敏反应（DTH）观察指标[8-9]。

1.6.2 血清溶血素生成水平 各组小鼠于给药第1天腹腔注射20% SRBC悬液0.2 mL/只，实验开始前禁食12 h。末次给药1 h后，眼底静脉丛取血，放置1 h，用长针将凝固血与管壁剥离，使血清充分渗出，2000 r/min离心10 min，并用生理盐水将离心后的血清按1∶500比例稀释，将稀释后的血清1 mL 10%SRBC悬液0.5 mL和1 mL 10%豚鼠血清加入5 mL离心管中，轻轻颠倒混匀。离心管放置于试管架上，37℃水浴保温10 min，取出置于冰浴中10 min终止反应，冷却后离心（4000 r/min，10 min），并取1 mL上清液和3 mL都氏液加入玻璃试管中，混匀后静置10 min，随后倒入一次性比色皿中，在波长540 nm处测定A值。另取一试管加入0.25 mL SRBC悬液和都氏液3.75 mL，测定SRBC半数溶血时的A值。样品血清溶血素生成水平（HC50）=（样本A值/SRBC半数溶血时A值）×血清稀释倍数[10-13]。

1.6.3 胸腺、脾脏系数 小鼠处死后，摘取胸腺、脾脏称量湿重，计算胸腺、脾脏系数。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间两两比较，采用最小显著法检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠耳廓皮肤迟发性超敏反应比较

与空白对照组比较，模型组小鼠耳肿胀度显著降低（P < 0.01）。与模型组比较，十五味云鹏散含汞制剂高、中、低劑量组和无汞制剂高、中、低剂量组小鼠耳肿胀度有所升高，但差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.2 各组小鼠血清溶血素生成水平比较

与空白组比较，模型组小鼠HC50明显降低（P < 0.01），与模型组比较，十五味云鹏散含汞制剂高、中剂量组和无汞制剂高、中剂量组HC50均明显升高（P < 0.01）。

2.3各组小鼠脾脏系数和胸腺系数比较

与空白组比较，模型组小鼠脾脏系数、胸腺系数显著下降（P < 0.05，P < 0.01）；与模型组比较，十五味云鹏散含汞制剂高、中剂量组和无汞制剂高、中剂量组小鼠脾脏系数、胸腺系数明显升高（P < 0.05，P < 0.01）。

3 讨论

环磷酰胺是一种烷化类的免疫抑制剂，可杀伤淋巴细胞，抑制免疫反应，它诱导的免疫低下模型是研究药物免疫活性的常用模型[9]。本试验通过连续3 d小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液50 mg/kg 1次，制备免疫功能低下的动物模型，动物处死后开腹查验，发现脾脏和胸腺明显萎缩，检测发现HC50降低，表明小鼠非特异性免疫和体液免疫功能明显下降，证明造模成功。

胸腺和脾脏是重要的免疫器官，成年动物脾脏是其最大的免疫器官，内含大量的免疫细胞，其中T淋巴细胞约占40%，B淋巴细胞约占60%，在细胞免疫和体液免疫中的地位极其重要[14]。其质量的变化可反应体内淋巴细胞数量的变化，间接提示机体的免疫应答水平，因此，本研究选用胸腺系数和脾脏系数评判机体免疫功能。血清溶血素检测法是反映体液免疫功能状况的一种方法，溶血素主要由IgM和IgG组成，如果用药后溶血素生成增多，则出现红细胞溶血时的吸光度值增高，表明用药后机体的体液免疫作用增强[15]。溶血素测定法的原理是经SRBC免疫过的动物，其B淋巴细胞可以产生抗SRBC的抗体-溶血素。分离出致敏动物的血清，与绵羊红细胞一起作用，在补体参与下可以产生溶血现象，溶血程度中释放的血红蛋白含量来测定[16]。由此可知，血清溶血素水平高低可以反映出机体体液免疫功能的强弱。DTH是细胞免疫反应，当致敏T淋巴细胞再次接触相同的抗原时，能引起迟发型变态反应，T淋巴细胞释放出多种细胞因子，产生以单核细胞浸润为主的炎症，表现为皮肤红肿、硬结等[17]。

在本实验中，通过小鼠DTH和血清溶血素抗体生成反应，观察十五味云鹏散含汞制剂和无汞制剂对免疫低下小鼠的免疫功能的作用；结果显示，十五味云鹏散含汞制剂高、中剂量组和无汞制剂高、中剂量组可改善免疫低下小鼠胸腺系数和脾脏系数，小鼠耳肿胀度，提高免疫低下小鼠HC50值。结果提示，十五味云鹏散含汞制剂和无汞制剂能够促进机体体液免疫功能，并且能够缓解小鼠免疫功能低下引起的胸腺和脾脏的萎缩，对免疫器官具有一定的保护作用。这可能与方剂中诃子、余甘子和宽筋藤等药物成分有关。研究表明诃子主要含有鞣质类、三萜皂苷类、黄酮类、糖类等成分；多糖作为诃子中一类活性成分，具有免疫调节、抗氧化等作用[18-22]。余甘子能增加小鼠血清溶血素含量，明显增强小鼠巨噬细胞吞噬功能，改善迟发型变态反应，促进T淋巴细胞增殖，对小鼠特异性细胞免疫功能有促进作用；能提高NK细胞活性，增强小鼠非特异性细胞免疫功能[23]。宽筋藤有调节免疫和阻止环磷酰胺诱发贫血等作用，且其水提物升高小鼠白细胞的数量[24]。

研究结果表明：十五味云鹏散含汞制剂和无汞制剂对环磷酰胺所致的小鼠免疫功能低下具有一定的调节改善作用，能改善小鼠DTH，增强小鼠血清溶血素抗体、提高小鼠胸腺系数和脾脏系数，提示该药能够增强机体非特异性免疫功能和特异性免疫功能。

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（收稿日期：2016-09-19 本文编辑：李岳泽）