磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因启动子—232多态性与动脉硬化性脑梗死关系的研究

刘秦　邵明

[摘要] 目的 探讨磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（PCK1）启动子-232位点基因多态性与动脉硬化性脑梗死的关系。 方法 选择2012年5月～2013年2月在广州医科大学附属第一医院（以下简称“我院”）神经内科住院的动脉硬化性脑梗死患者128例为脑梗死组，同时选择在我院体检中心体检的70名健康成人为对照组。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法，进行PCK1启动子-232基因多态性分析；测定血糖、血脂；颈动脉超声多普勒检查颈总动脉内膜中层厚度（IMT）及颈动脉斑块。 结果 脑梗死组GC、GG基因型餐后2 h血糖及低密度脂蛋白胆固醇水平均高于CC基因型，差异有统计学意义（P < 0.05）。脑梗死组GC、GG基因型及G等位基因频率明显高于对照组（P < 0.05）。脑梗死组GG+GC基因型及G等位基因在易损斑块和非易损斑块中的分布情况比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。两组不同基因型之间左、右侧颈总动脉IMT比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 PCK1启动子-232基因多态性与广东地区汉族人群动脉硬化性脑梗死的关系密切，G等位基因可能是脑梗死的易感因素。

[关键词] 脑梗死；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；启动子；基因多态性

[中图分类号] R743 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0036-05

[Abstract] Objective To study the relationship between the polymorphism of phosphoenolpyruvate carboxykinase （PCK1） gene promoter-232 and atherosclerotic cerebral infarction. Methods 128 patients with atherosclerotic cerebral infarction admitted in Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University （"our hospital" for short） from May 2012 to February 2013 were selected as cerebral infarction group， and 70 healthy adults were selected as control group in the physical examination center of our hospital. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） was used to analyze the PCK1 promoter-232 gene polymorphism. The blood glucose and plasma lipids were measured. The carotid intima-media thickness （IMT） and CAP were detected with carotid ultrasonagraphic Doppler. Results Postprandial 2 h blood glucose and low density lipoprotein cholesterol levels of GC， GG genotype in cerebral infarction group were significantly higher than those of CC genotype， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The ratio of GC， GG genotype and G allele in cerebral infarction group were significantly higher than those in control group （P < 0.05）. The distribution of GG+GC genotype and G allele in vulnerable plaque and vulnerable plaque of cerebral infarction group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. IMT of left and right carotid artery different genotypes in two groups were compared， with no statistical difference （P > 0.05）. Conclusion PCK1 promoter-232 gene polymorphism is closely correlated with atherosclerotic cerebral infaction， G allele may be a predisposing factor for cerebral infarction.

[Key words] Cerebral infarction； Phosphoenolpyruvate carboxykinase； Promoter； Gene polymorphism

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（PCK1）所編码磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK-C），是糖异生和甘油异生的限速酶[1-3]，PCK1的表达受胰高血糖素和胰岛素的调控，前者促进，后者抑制[4-6]。PCK1存在多个限制性片断长度多态性位点，特别在PCK1启动子区的-232G→C，有试验证实与2型糖尿病、胰岛素抵抗及肥胖相关[1，7]，但关于PCK1启动子-232基因多态性与缺血性脑卒中之间关系的研究极少，本研究就此进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

连续收集2012年5月～2013年2月在广州医科大学附属第一医院（以下简称“我院”）神经内科住院患者128例为脑梗死组，其中男60例，女68例，年龄为45～81岁，平均（66.70±10.08），所有患者均有动脉硬化性脑梗死的临床特征，并通过头颅CT和/或头颅MR和MRA明确诊断，除外非动脈硬化性脑梗死、梗死后出血和脑出血。对照组为我院体检中心体格检查的健康成人，无脑血管病及脑血管病家族史，共70名，其中男38名，女32名，年龄为37～82岁，平均（63.67±11.12）。所有研究对象均为广东地区汉族自然人群，饮食结构相似，对象之间无血缘关系，排除肝肾功能不全、自身免疫性疾病、合并慢性感染性疾病、心房颤动、心瓣膜病、甲状腺疾病、血液疾病、恶性肿瘤等，并签署知情同意书。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 标本 征得参加者同意后，采集空腹静脉血各两个试管，每管2 mL，分为EDTA抗凝管和非抗凝管，抗凝管用于血基因组DNA提取，-80℃冰箱保存；非抗凝管用于检测空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）等生化指标，并在同一日抽取餐后2 h血糖。

1.2.2 颈动脉超声检测 由我院B超室固定技师完成操作。采用美国产GE Vivid 7型彩色多普勒超声心动仪，探头中心频率7.0 MHz，分别检测双侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈总动脉分叉处及颈内动脉颅外段纵横轴实时二维图像。舒张末期测量CCA近端1 cm、CCA分叉处及颈内动脉起始端1 cm后壁的内膜中层厚度（intima-media thickness，IMT），双侧各测量3次IMT，取其平均值。仔细观察血管内膜及有无斑块，斑块的形态、大小及性质。IMT诊断标准：①至少一个动脉段的单个最大IMT 1.0 mm或局部有斑块（IMT ≥ 1.2 mm可被诊断为斑块）；②由以上而引起的管腔狭窄，依据第一点即可明确诊断。其中脑梗死组111例，对照组66例行颈动脉彩超检查。易损斑块及非易损斑块分类方法参照相关超声诊断标准[8]。

1.2.3 基因组DNA提取及PCR反应 解冻保存的外周全血，取500 μL用血液基因组试剂盒抽提基因组DNA，方法按试剂说明书进行，抽提的基因组DNA置-20℃冷冻保存备用。应用Primer Primer 5.0软件并根据GenBank中序列设计、合成所需引物。上游引物为：5′-TGACATCTTATAGCTGTGGTGT-3′；下游引物为：5′-GTGCATTGCCAAATAGTTATTG-3′。

PCR反应体系：总体积为25 μL，基因组DNA 2 μL，上下游引物各0.2 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 15.1 μL。PCR扩增条件：预变性94℃ 2 min；变性94℃ 45 S，退火52℃ 30 S，延伸72℃ 45 S，共36个循环；72 ℃延伸5 min。反应完成后吸5 μL用1%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后检测。取PCR产物15 μL用试剂盒进行纯化，纯化后用20 μL双蒸水进行溶解。

1.2.4 限制性片断长度多态性分析 取PCR产物10 μL，内切酶MaeⅢ 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 12 μL以上各物混匀后，置56℃水溶箱中水溶2 h。取出用1%有琼脂糖凝胶电泳检测酶切后带型。

1.2.5 基因计数法 基因型、等位基因频率采用基因计数法，等位基因频率=（2×纯合子+杂合子）/（2×受检人数）。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组比较正态分布资料采用t检验，非正态分布资料采用两独立样本的非参数检验；多组比较采用单因素方差分析；计数资料采用χ2检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因型的判定

根据Hardy-Weinberg遗传平衡定律，计算PCK1启动子-232多态性基因型分布，检验结果符合Hardy-Weinberg遗传平衡，认为两组来自平衡群体，具有代表性。见图1。

2.2 PCK1启动子-232基因多态性与血糖的关系

脑梗死组及对照组PCK1启动子-232不同基因型间空腹血糖水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；脑梗死组GC、GG基因型餐后2 h血糖水平明显高于CC基因型（P < 0.05），GG与GC基因型间餐后2 h血糖水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；对照组PCK1启动子-232不同基因型间餐后2 h血糖水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.3 PCK1启动子-232基因多态性与血脂的关系

脑梗死组及对照组PCK1启动子-232不同基因型间总胆固醇、三酰甘油、HDL-C水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；脑梗死组GC、GG基因型LDL-C水平明显高于CC基因型（P < 0.05），GC与GG基因型间LDL-C水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；对照组PCK1启动子-232不同基因型间LDL-C水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.4 PCK1启动子-232基因多态性与颈总动脉IMT和斑块的关系

2.4.1 PCK1启动子-232基因多态性与颈总动脉IMT的关系 两组PCK1启动子-232不同基因型间左、右侧颈总动脉IMT比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

2.4.2 PCK1启动子-232基因多态性与颈动脉斑块的关系 脑梗死患者中有斑块者共95例，其中易损斑块42例，非易损斑块组53例；易损斑块组中GG型16例、GC型20例，非易损斑块组中GG型9例、GC型29例（由于GG型病例数较少，因此与GC型合并计算）。脑梗死组GG+GC基因型及G等位基因频率与易损斑块有关系，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表4。

2.5 PCK1啟动子-232基因多态性与脑梗死的关系

脑梗死组GC、GG基因型频率显著高于对照组，CC基因型频率低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；脑梗死组G等位基因频率高于对照组，C等位基因频率低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表5。3 讨论

2010年，脑卒中成为我国第一位死亡原因[9-10]，其中缺血性脑卒中占60%～80%[11]，动脉粥样硬化是缺血性脑卒中的重要致病因素[12]，血糖、血脂代谢异常、胰岛素抵抗是动脉硬化性脑梗死已经明确的危险因素[13-16]。

动物试验显示，在肝脏中过度表达PEPCK-C或在脂肪组织中减少PEPCK-C表达均可能引起2型糖尿病[1]。2004年，Cao等[7]首次报道了在加拿大人群中，人类PCK1启动子-232位点发生G→C的突变，会增加肝脏PEPCK-C的表达，从而增加患2型糖尿病的风险（OR = 2.8，95%CI：1.7～4.7，P = 0.000 04）；在香港，也有针对南中国地区人群类似的研究支持该位点的突变与2型糖尿病相关[17]。目前的研究多集中于PCK1多态性与肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征等疾病的相关性[18-20]。

2005年，Hegele等[21]报道，具有PCK1-232 G/G基因型的人群颈动脉IMT明显高于其他基因型[（0.80±0.02）比（0.73±0.03）mm，P = 0.007]，但在颈动脉斑块数量上却少于其他基因型，在国内，也有研究发现，在PCK1其他基因位点多态性与颈动脉IMT有关[22]，既往研究发现，PCK1启动子-232位点GC基因型与颈动脉粥样硬化相关[23]。

本文报道了PCK1启动子-232位点多态性与广东汉族人群动脉硬化性脑梗死发病存在相关性。本研究显示，启动子-232位点GC基因型及G等位基因与脑梗死有关，差异有统计学意义（P < 0.05），G等位基因可能是脑梗死的易感基因。同时，本研究发现，GC、GG基因型与CC基因型比较，餐后2 h血糖、LDL-C明显升高，因此推测PCK1该位点通过对血糖、血脂等因素来影响脑梗死的发生。

与既往的研究不同，我们发现PCK1启动子-232三个基因型间与颈动脉IMT无明显关系，但在易损斑块中，GG+GC基因型及G等位基因频率较非易损斑块升高（P < 0.05），提示该位点多态性可能与易损斑块的形成有关。

动脉粥样硬化性脑梗死是环境与遗传相互作用的多因素疾病，本研究结果仅是单基因研究得出的结论，同时还有研究对象数量及研究人群种族的局限性，因此更多的工作有待开展。

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（收稿日期：2016-09-18 本文编辑：李亚聪）