黄芩苷微生物转化菌的筛选鉴定及发酵条件优化

苏龙++梁广波++龙文英++张小晴++陈夏露++黄燕燕

摘要：通过罗尔夫青霉（Penicillium rolfsii）发酵培养基和发酵条件优化，来提升黄芩苷转化率。采用单因素方法对氮源、发酵接种量、初始pH发酵时间、发酵温度等因素进行考查，在此基础上进行L16（45）正交试验优化。得到的优化发酵条件是黄芩粉20 g/L，（NH4）2SO4 0.6 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，醋酸钠0.1 g/L，维生素C 0.1 g/L，MgSO4 0.1 g/L，pH 5.0，料液比为1∶30，接种量10%，装液量80 mL/250 mL，发酵温度35 ℃，发酵时间6 d，转速180 r/min。在最优条件下，黄芩素含量达到1.83 mg/mL。

关键词：黄芩苷；微生物转化；罗尔夫青霉（Penicillium rolfsii）；黄芩素；优化

中图分类号：Q946.83：Q936 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1483-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.021

Screening and Identify of the Baicalin Microbial Transformation and Optimization of Fermentation Conditions for Baicalein by Microorganism

SU Long，LIANG Guang-bo，LONG Wen-ying，ZHANG Xiao-qing，CHEN Xia-lu，HUANG Yan-yan

（College of Biology & Pharmacy of Yulin Normal University， Yulin 537000，Guangxi， China）

Abstract： The Penicillium rolfsii fermentation medium and conditions were optimized to increase the baicalin yield. Firstly， using single-factor test， the effects of these 5 parameters， i.e.， nitrogen source， the inoculation amount， initial pH of medium， fermentation time， fermentation temperature on the baicalin yield were studied. Then the key parameters of fermentation conditions were statistically optimized through orthogonal array experiments with 5 factors at 4 levels. The optimal conditions were Scutellaria baicalensis Georgi. power 20 g/L，（NH4）2SO4 0.6 g/L， KH2PO4 0.2 g/L， sodium salt 0.1 g/L， MgSO4 0.1 g/L， vitamin C 0.1 g/L， initial pH 5.0， solid liquid ratio 1∶30， rotation speed 180 r/min， 10% inoculum size in 80 mL working volume（in 250 mL flasks） at 35 ℃ for 6 d. Using these conditions， the baicalein yield was 1.83 mg/mL.

Key words： baicalin； microbial transformation； Penicillium rolfsii； baicalein； optimize

中草藥是自然界赋予华夏的特色药物，是中华民族历史文化和现代文明的主要组成部分之一，对国民经济和社会发展具有重要贡献，是提高汉文化民族健康素质的重要保障；并且在医药产业发展中发挥着极其重要的支柱性作用。中草药活性成分是中医药用之防治疾病的物质基础，然而中草药成分是一个复杂的庞大体系，往往很多成分活性低、毒性大、含量低、结构复杂、合成困难等，如黄芩素在植物中含量非常低，植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）中只有在根部含有少量黄芩素，约含0.49%～2.28%，而其前体物黄芩苷含量约为5.79%～15.31%[1]；现在的天然野生资源随着中草药的开发利用力度持续加大，储存量在不断下降；这样随之而来的问题是原料药来源已经无法满足批量化生产的需求，这也是所有天然创新药物开发所面临的重大难题，是高水平天然药物能否广泛应用、走向世界的瓶颈。

黄芩素为黄芩苷的水解产物，即黄芩苷元，它是黄芩主要的有效成分之一，来源于黄芩根部。化学结构属黄酮类[2]，具有降低脑血管阻力、抗血栓形成和保护心脑血管、神经元的作用[3]，能改善脑部血循环、增加脑血流量及抗血小板凝集，临床上多用于脑血管病后瘫痪的治疗；还具有抗菌、抗病毒、抑制炎症反应、保肝、利胆、利尿、抗癌[4]、抗氧化、抗过敏、抗病原微生物等功效，能镇静、降压，对治疗肝脏疾病等具有良好效果[5，6]。目前获得黄芩素的方法主要有酸水解法[7]、溶剂提取法[8]、超声提取法[9]、酶水解法[10，11]和微生物发酵法[12-15]。试验利用自行筛选的微生物青霉半固态发酵法转化黄芩苷为黄芩素，以期为黄芩苷的有效利用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 中药材黄芩购于玉林市至真药业连锁店，將其打粉，过40目筛，作为发酵底物备用。标准品黄芩苷、黄芩素（含量99.0%）购于西安市汇林生物公司；其他试剂均为分析纯，购于国药集团化学制剂有限公司。青霉为玉林师范学院生物与制药学院实验室保存。

1.1.2 仪器 主要有Tu21800 紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、HH-s数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）、FE20 Five Easy实验室pH计和AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.1.3 培养基 ①初筛培养基组成：黄芩苷标准品2 g，琼脂2 g，用去离子水定容到100 mL，分装，121 ℃高压灭菌20 min。②复筛培养基组成：黄芩苷标准品1 g，KH2PO4 0.01 g，醋酸钠0.005 g，维生素C 0.005 g，MgSO4 0.005 g，pH自然，用去离子水定容到50 mL，分装，121 ℃高压灭菌20 min。③发酵基础培养基组成：黄芩粉20 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，醋酸钠0.1 g/L，维生素C 0.1 g/L，MgSO4 0.1 g/L，pH自然，分装，121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株初筛 配制好初筛培养基平板，从实验室中草药转化菌种库中筛选能转化黄芩苷为黄芩素的青霉菌株；通过2%的三氯化铁（用无水乙醇配制）溶液显色，初步筛选出目的菌株。

1.2.2 菌株复筛 将初筛的青霉菌株接种至复筛液体培养基中，于35 ℃、200 r/min的摇床中培养5 d；取发酵液4 000 r/min离心20 min，弃上清液取沉淀，向沉淀内加入无水乙醇浸泡过夜，第二天80 ℃水浴1 h（每20 min摇晃1次），最后拿出，置于离心机4 000 r/min离心20 min；取上清液0.1 mL，加入2%三氯化铁4 mL，再加入无水乙醇0.9 mL，于紫外可见分光光度计的490 nm处测定[16]。

1.2.3 菌株鉴定 将筛选及纯化好的菌株委托上海美吉生物医药科技有限公司鉴定。

1.2.4 黄芩素标准曲线测定 精密称取120 ℃干燥到恒重的黄芩素标准品10 mg，置10 mL容量瓶中，加无水乙醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，得各组成浓度分别为0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的系列标准溶液；分别于490 mn处测定各浓度的吸光度，得回归方程，样品含量利用回归方程计算即得[16]。

1.3 单因素试验

以黄芩素含量为依据，以黄芩粉为底物，分别考察青霉半固态发酵法转化黄芩苷发酵培养基的不同氮源[蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、黄豆粉、（NH4）2SO4、尿素、不添加（对照）]、不同氮源浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L）、培养基不同初始pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、不同接种量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、不同装液量（40、60、80、100、120、140 mL/250 mL）、不同料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40）、不同发酵温度（20、25、30、35、40、45 ℃）、不同发酵时间（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5 d）对黄芩素含量的影响。

1.4 L16（45）正交试验设计优化

在单因素试验的基础上，以发酵温度、发酵液pH、料液比、发酵时间、氮源浓度为影响因素，各因素都有4个水平，进行青霉半固态发酵法转化黄芩苷L16（45）正交试验，L16（45）正交试验各因素、水平组合见表1。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选及鉴定

经过初筛、复筛和发酵检测筛选，得到一株能把黄芩苷转化为黄芩素的青霉菌株，结果见图1。将测定菌株的ITS序列用Blast软件与GenBank中已报道的ITS序列进行同源性比较后发现，菌种的ITS序列与在GenBank登记的Penicillium rolfsii（罗尔夫青霉）ITS序列的同源性达到99%；通过对菌株的菌落形态及结合ITS序列同源性比较，可以确定菌种为罗尔夫青霉。

2.2 黄芩素标准曲线

根据所获得的不同黄芩素标准品浓度溶液的吸光度，做出黄芩素的标准曲线，具体见图2。黄芩素标准曲线的线性回归方程为y=21.108x-0.192 6，R2=1。

2.3 氮源对黄芩素含量的影响

不同氮源对黄芩苷转化的影响见图3。从图3可以看出，氮源种类对黄芩苷的转化影响不大，无论是添加有机氮源还是无机氮源，对黄芩素含量的影响都差不多；对照中不添加氮源，虽然黄芩素的含量比添加氮源的少，但也能发生部分转化，可能是由于黄芩药材来源于植物根部，含有多糖类和蛋白质等成分，经微生物分解后即产生大量的碳源和氮源，可满足微生物的生长营养需求。从总体来看，添加氮源比不添加氮源黄芩苷的转化率更高，另外从成本方面考虑，（NH4）2SO4为最佳氮源。

2.4 （NH4）2SO4浓度对黄芩素含量的影响

进一步比较（NH4）2SO4对黄芩苷转化的影响，结果见图4。从图4可见，随（NH4）2SO4浓度的增加，其发酵液中黄芩素含量呈先增加、后减少的变化趋势，在（NH4）2SO4浓度为0.4 g/L时，含量达到最大值。反映出（NH4）2SO4浓度过大后，会使菌体生长过于旺盛，但不利于代谢产物的积累。因此（NH4）2SO4浓度以0.4 g/L为较合适。

2.5 培养基初始pH对黄芩素含量的影响

培养基不同初始pH对黄芩苷转化的影响见图5。相对于培养基最适pH而言，过高或者过低的环境初始pH都会影响到罗尔夫青霉的生长，进而影响罗尔夫青霉的次级代谢产物——β-葡萄糖苷酶的分泌，更影响到酶的催化反应。根据文献的报道和前期的预备试验可知，大部分β-葡萄糖苷酶的最适作用环境是酸性的[17-22]，所以试验设计培养基初始pH为酸性。从图5可见，当培养基初始pH在4.0～4.5范围时，发酵液中的黄芩素含量相差不大，而pH低于4.0或高于4.5后，黄芩素的含量相应减少，故培养基初始最适pH选择4.5。

2.6 菌种接入量对黄芩素含量的影响

菌种接入量对黄芩素含量的影响情况见图6。通常接种量的大小决定了生产菌种在培养中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会；但接种量过大或者过小，均会影响发酵结果。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低生产效率。从图6可以看出，随着接种量的增加，发酵液中黄芩素的含量逐渐增加，其中接种量为8%和10%时，黄芩素的含量最高；超过10%后，黄芩苷转化率开始下降。考虑到罗尔夫青霉生长速度比较慢，选择10%的接种量为最佳接种量。

2.7 装液量对黄芩素含量的影响

氧气是好氧微生物能正常生长繁殖的重要因素之一，溶氧的多少直接影响微生物生长，并影响β-葡萄糖苷酶的产量，进而影响发酵转化率。不同菌种发酵、发酵生产不同的产物对溶氧量要求不尽相同；对于选定的菌种和发酵生产特定的产物对溶氧的要求，可利用装液量来探讨溶氧的影响。一般是装液量小的培养基与氧气的接触面积大，增加了液体的溶氧量；反之，装液量大的溶氧量较少。试验里装液量对黄芩素含量的影响见图7。由图7可见，当装液量为80 mL/250 mL（三角瓶）时，黄芩素的含量最高；装液量过多或过少，黄芩素的含量都减少。另外，装液量与转化环境的溶氧量有直接的关系，增大溶氧量有利于细胞生长、产酶，进而促进黄芩素的产生；装液量太少，将导致细胞生长过快，营养物质消耗加速，反而会影响β-葡萄糖苷酶的分泌，进而影响转化的进程。因此，在转化黄芩苷时，培养基的装液量以80 mL/250 mL（三角瓶）为宜。

2.8 料液比对黄芩素含量的影响

由于发酵底物是黄芩打粉过40目筛后直接添加到培养基中，所以属于半固态发酵，因此培养基含水量是一个很重要的影响因素；包被在固态基质表面的水膜能溶解微生物需要的无机盐和代谢产物，同时为微生物的生长提供了所需的潮湿环境。另外，基质含水量也影响着培养系统中的氧气供应、气体流动等微环境，也是发酵成败的制约条件，所以，料液比对半固态发酵有着重要的影响。试验里料液比对黄芩素含量的影响情况见图8。由图8可知，随着料液比的增加，发酵液中黄芩素的含量也相应增加，但当料液比>1∶35以后，黄芩苷的转化率开始下降。在低料液比（1∶15）时，随着发酵的进程，由于水分的蒸发，底物粘性提高，导致底物结块现象严重，通透性降低，溶氧传递与吸收也降低，限制了菌株的生长代谢，最后直接影响菌体的生长，导致转化率下降；料液比高时，底物流质状态不理想，溶氧少及传递效果差，菌体代谢得不到充分发挥，造成资源浪费；所以料液比选择1∶30较为适宜。

2.9 发酵温度对黄芩素含量的影响

温度是影响微生物生长和存活的主要环境因素之一，对发酵的影响很大，温度的高低影响酶的反应、氧的溶解和传递速率、菌体生长及产物合成等方面。试验里发酵温度对黄芩素含量的影响情况见图9。由图9可知，35 ℃发酵时黄芩素的含量最高。20 ℃发酵时黄芩素的含量最少，说明20 ℃使罗尔夫青霉生长缓慢，还没有β-葡萄糖苷酶的分泌或者分泌的酶量比较少，造成黄芩素的含量比较少。而温度过高，虽然菌种生产速度加快，但也有可能营养成分消耗过快，β-葡萄糖苷酶的分泌量也会减少，导致黄芩素的含量下降；另外，也可能温度过高不适合β-葡萄糖苷酶的转化反应。

2.10 发酵时间对黄芩素含量的影响

发酵时间对黄芩素含量的影响情况见图10。由图10可知，随着发酵时间的延长，黄芩素的含量逐渐增加，在接种发酵第六天时，黄芩素的含量达到最大；继续延长发酵时间，黄芩素的含量则有下降的趋势。发酵时间不仅影响微生物的生长速率和生长量，还会影响微生物的代谢强度和代谢物的多寡；β-葡萄糖苷酶属于罗尔夫青霉的次级代谢产物，一般是微生物生长到中后期才开始分泌；发酵时间的延长使得菌体的代谢产物β-葡萄糖苷酶的量增大，從而提高了黄芩苷的转化率，故发酵时间选择6 d。

2.11 发酵条件L16（45）正交试验

试验设置的罗尔夫青霉半固态发酵法转化黄芩苷L16（45）正交试验结果及分析见表2。从表2可见，通过对L16（45）正交试验的结果进行分析，可知对黄芩苷转化影响因素的高低排序为D、A、B、E、C，即料液比、（NH4）2SO4浓度和培养基初始pH对黄芩苷转化的影响较大，发酵时间对黄芩苷转化的影响较小，发酵温度对黄芩苷转化的影响最小。最佳的组合为A4B4C2D2E3，即发酵温度35 ℃、培养基初始pH 5.0、（NH4）2SO4浓度0.6 g/L、料液比为1∶30、发酵时间为6 d。经验证试验检测，在上述最优条件下，黄芩素含量最高，达1.83 mg/mL。

3 小结

通过单因素和L16（45）正交试验，对罗尔夫青霉发酵黄芩粉转化黄芩素的条件进行了优化。结果最优的发酵条件为黄芩粉20 g/L、（NH4）2SO4浓度0.6 g/L、KH2PO4浓度0.2 g/L、醋酸钠浓度0.1 g/L、维生素C浓度0.1 g/L、MgSO4浓度0.1 g/L、发酵温度35 ℃、培养基初始pH 5.0、料液比为1∶30、接种量10%、装液量80 mL/250 mL、发酵时间为6 d。在此最优条件下，发酵产物的黄芩素含量达到1.83 mg/mL。

中草药活性成分是中草药防病治病的物质基础，也是中草药现代化研究的重要内容之一。微生物转化技术在中草药活性成分的现代化研究中具有十分重要的作用，已经广泛应用于中草药活性成分的合成、结构修饰以及新化合物的开发中。微生物转化可以有效地提高已知中草药活性成分的药效，降低毒副作用，改善水溶性和生物利用度，还可以用来生产具有重要应用价值的微量天然活性先导化合物，同时可用于药物代谢机制的研究。试验通过对罗尔夫青霉半固态发酵法转化黄芩苷为黄芩素的条件进行了优化，试验结果对中草药生物活性的转化具有一定的参考价值。该方法条件温和、易于控制，转化率高，可极大地提高中草药黄芩的利用率。

致谢：试验得到了广西壮族自治区农产品加工重点实验室（培育基地）、广西生物化工、农产品深加工与安全技术创新团队的帮助，谨此致谢。

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