富硒酵母的筛选鉴定及其作为鱼饲料的应用研究

凡敏++黄珍++李欣++王志++陈雄++代俊

摘要：将泡菜汁样品稀释后涂布到含1 g/L Na2SeO3的YEPD培养基上，筛选出一株耐硒菌株FXY-4，用不同Na2SeO3浓度的YEPD培养基培养，发现Na2SeO3的浓度为0.5 g/L时菌株富硒能力最强，为0.54 mg/g（干重）。运用分子生物学和生理生化方法鉴定FXY-4为光滑假丝酵母（Candida glabrata）。将FXY-4添加在鱼饲料中喂食锦鲤，探究其对锦鲤的生长与血清酶学指标的影响，结果显示添加菌株FXY-4能提高锦鲤生长、免疫学指标和鱼肉中有机硒的含量。

关键词：硒；光滑假丝酵母（Candida glabrata）；鉴定；鱼饲料

中图分类号：S816.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1416-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.004

Isolation，Identification and Application Research of Fish Feed of Selenium-rich Yeast

FAN Min， HUANG Zhen， LI Xin， WANG Zhi， CHEN Xiong， DAI Jun

（Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation/Key Laboratory of Fermentation Engineering Ministry of Education/College of Bioengineering and Food，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China）

Abstract： A selenium-rich strain FXY-4 in pickle juice was screened from YEPD medium containing 1 g/L Na2SeO3. The concentration of Na2SeO3 of strain FXY-4 was 0.54 mg/g（dry weight） in YEPD culture of 0.5 g/L selenium. Using molecular biology and physiological and biochemical methods，FXY-4 was identified as Candida glabrata. Fish feed containing strain FXY-4 was fed to koi. It showed that feed could increase the growth， immunological parameters and organic selenium content of koi.

Key words： selenium； Candida glabrata； identity； fish feed

隨着生物医学技术的发展，硒（Se）对人体的重要性已逐渐被证实并引起了人们的高度重视。作为人体必需的14种微量元素之一，硒具有抗癌、解毒、保肝和提高人体免疫力等重要生理功能，缺硒会引起人体重要器官功能的失调并最终导致多种疾病的发生[1]。硒也是动物体必需的微量元素，在对动物机体抗应激、促进生长、提高免疫力等方面发挥着重要作用[2]。鱼类饲料中硒的营养学研究表明，饲料中过高或过低的硒含量均会影响鱼类健康，因此硒在动物饲料中最适添加量的研究得到了广泛开展。在水产养殖过程中，一些致病菌能迅速繁殖，进而引发相应的疾病[3]。目前，主要是通过在饲料中添加抗生素的方法来控制解决。然而，抗生素在饲料中的大量使用存在着严重的弊端，如引起内源性感染和二重感染、耐药菌株的产生、免疫力下降和水产品及环境中残留等[4]。相比之下，酵母具有安全、无污染、免疫增强等优点，成为抗生素替代品[5]。筛选得到富硒能力强的酵母，对水产养殖业具有重要的现实意义。目前，关于高产富硒光滑假丝酵母（Candida glabrata）在水产养殖饲料中的应用鲜见报道。

本研究从泡菜中培养得到一系列酵母菌单菌落，通过亚硒酸抗性筛选，得到具有增强免疫和抗应激功能的富硒能力强的酵母菌株。对该菌株进行鉴定，并研究在饲料中添加该菌株后对锦鲤体重、血清酶指标等的影响，以期为强化动物饲料的营养价值、减少抗生素在饲料中的添加提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

泡菜为湖北农家自制。

主要试剂有酵母粉、蛋白胨、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾、盐酸、葡萄糖、氯化钠、氯化钾、环己烷、氨水、硫酸、磷酸、琼脂粉、亚硒酸钠、浓硝酸、溶菌酶（Lysozyme）、蛋白酶K（Protease K）、RNase A、氯仿、异戊醇、水饱和酚、磷酸缓冲液（PBS）EX-Taq DNA聚合酶，购自上海申试化工工贸公司或宝生物工程（大连）有限公司。

主要仪器有生物安全柜，Esco公司；恒温水浴锅（双哈SSY-H型）、恒温振荡培养箱（HZQ-F160型）、全自动控制卧式电热蒸汽消毒器（双哈YX600W型），东联电子技术开发有限公司；隔水式恒温培养箱（GNP-9160BS-III型），新苗医疗器械制造公司；琼脂糖凝胶电泳仪（Mupid-2plus），Advance（日本）；紫外凝胶成像系统（DRC-100H/DIX-254A型），Gene公司（美国）。

1.2 菌种的筛选

YEPD液体培养基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母粉1%、pH 7.0；加2%琼脂即成固体培养基。

称取1.0 mL泡菜汁加入盛有9 mL无菌水的试管中，在涡旋器上充分振荡10 min，然后静置5 min，采用10倍梯度稀释法将上清液制成10-2、10-3、10-4、10-5稀释液分别涂布到含1 g/L的Na2SeO3 YEPD平板上，倒置，于28 ℃培养箱中培养，观察菌落生长状态、菌落大小和菌落形态，并挑取单菌落，将其命名为FXY-4，转接到YEPD斜面上保存。

1.3 菌株富硒能力测定

将Na2SeO3溶液过滤除菌后加入到YEPD培养基中，配成终浓度分别为0.1、0.5、1.0 g/L的Na2SeO3的培养液。接种后30 ℃培养24 h，先用紫外分光光度计测定OD600 nm，再采用国家标准（GB 5009.93-2010）原子荧光光度计法测定硒元素含量。用未加Na2SeO3的YEPD培养基作为对照。

选取培养18～24 h的FXY-4菌体，用灭菌棉签刮下3 mm左右的待测菌落2～3个，置于装有3 mL 0.45%生理盐水的试管中进行稀释，用标准比浊计测菌液浓度（约0.5个麦氏单位），用菌液填充卡片，置于读数器进行自动读卡。

1.4 酵母基因组提取

染色体DNA的提取步骤[6]如下，①取1.5 mL菌液于1.5 mL EP管中，12 000 r/min离心5 min；②弃上清，900 μL磷酸缓冲液（PBS）重悬沉淀，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min；③弃上清，加入300 μL TE和200 μL 10 mg/mL溶菌酶，混匀，37 ℃温育1 h，每隔15 min颠倒混匀一次；④向沉淀加入600 μL TENS裂解液（200 mmol/L NaCl，100 mmol/L Tril-HCl pH 8.0， 2.0% SDS，50 mmol/L EDTA，0.5% Triton X-100）和20 mg/mL蛋白酶K 10 μL，混匀，55 ℃温育1 h，每隔15 min颠倒混匀一次；⑤4 ℃ 12 000 r/min离心5 min，取上清；⑥向上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）充分混匀，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；⑦重复步骤6；⑧将上清转入新的EP管中，加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠，2倍体积的无水乙醇，混匀，-20 ℃放置60 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；⑨弃上清，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体后风干，加入30 μL无菌水和10 mg/mL RNase A 0.5 μL，-20 ℃保存。

1.5 26S rRNA基因扩增和测序

根据Kurtzman等[7]的方法，引物为NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′），PCR扩增体系：Premix Taq酶25 μL，上游引物20 μmol/L 1 μL， 下游引物20 μmol/L 1 μL，模板DNA 200 ng/μL 1 μL，无菌水22 μL，总体积50 μL。PCR扩增条件：预变性，94 ℃，10 min；变性，94 ℃，30 s；退火，60 ℃，1 min；延伸，72 ℃，1 min，30个循环；再延伸，72 ℃，10 min。

1.6 26S rRNA基因序列同源性和系统发育分析

将测序后的26S rRNA基因序列通过BLAST[8]比对程序进行同源性分析。利用Clustalx1.8、 MEGA 5.0软件，根据26S rRNA基因序列相似度分析的结果，选取相关模式菌株的26S rRNA基因序列，采用Neigbor-joining（邻位相接法，NJ）算法得到相应的系统发育树[9]。

1.7 富硒光滑假丝酵母FXY-4作为鱼饲料添加剂的应用

采用400条体重相近、健康的锦鲤（约1.80 g/条），随机分成4个处理组，每个处理4个重复，每个重复25条。处理1为对照（CK），商业饲料，不含任何药物添加剂；处理2为抗生素饲料，在商业饲料中添加一定量抗生素；处理3为低量添加富硒光滑假丝酵母FXY-4饲料，在商业饲料中补给富硒光滑假丝酵母FXY-4（饲料中终浓度为5×108 CFU/kg）；处理4为高量添加富硒光滑假丝酵母FXY-4饲料，在商业饲料中补给富硒光滑假丝酵母FXY-4（饲料中终浓度为5×1010 CFU/kg），每天投食量按照体重的3%投食2次，喂食30 d后，测定锦鲤体重与血清中过氧化氢酶（CAT）及超氧化物歧化酶（SOD）活性[10]。

1.8 喂食富硒酵母FXY-4饲料对鱼肉中硒含量的测定

随机挑取喂食高量添加富硒酵母FXY-4饲料的锦鲤50条，解剖后混匀鱼肉，称取2.0 g（精确至0.1 mg），放入100 mL烧杯中，加10 mL HNO3浸泡过夜，再加入2 mL HClO4，同时用无富硒酵母FXY-4饲料作为空白对照，摇匀，于电热板上低温加热硝化至白烟冒尽，如果硝解液为黑色或酱褐色，则补加HNO3继续硝化至黑色或酱褐色消失且溶液呈淡黄色，剩余约1 mL溶液时，加入5 mL 6 moI/L HCl，加热微沸5～10 min，冷却，洗入25 mL容量瓶中，用6 mol/L HCl稀释至刻度。采用国家标准方法（GB 5009.93-2010）—原子荧光光度计法测定硒元素含量。

2 结果与分析

2.1 富硒酵母的分离纯化

在1 g/L的Na2SeO3 YEPD平板上培养3 d，挑取出一株直径1～2 mm、圆形、乳白色、表面蜡状光泽的FXY-4单菌落。通过显微镜下观察发现其细胞大小为（3～4） μm×（6～7） μm，椭球形，初步判定为酵母菌属。菌体在0.1、0.5、1.0 g/L Na2SeO3的YEPD培养液中30 ℃培养24 h后，OD600 nm分别为15.4、5.3、2.1，运用国标荧光法检测富硒含量分别为0.39、0.54、0.51 mg/g（DW）。综合菌体在不同Na2SeO3浓度下的生长状况和富硒能力，后续制作饲料时选择0.5 g/L Na2SeO3的培养浓度。

2.2 Bio Mérieux VITEK 2鉴定

分别运用Bio Mérieux VITEK 2自动鉴定分析仪和26S rRNA基因测序技术对FXY-4进行生理生化特性鉴定（表1）。由表1可知，FXY-4与光滑假丝酵母具有相同特征的生理生化反应[11]。

2.3 26S rRNA基因序列分析

2.3.1 菌株FXY-4 26S rRNA基因序列 测序结果显示，菌株FXY-4的26S rRNA基因约570 bp。

2.3.2 菌株FXY-4 26S rRNA基因系统发育树 将测序后的26S rRNA基因序列通过BLAST比对程序进行同源性分析，FXY-4 26S rRNA基因与Candida glabrata种几十种菌株的相似度为100%。挑选17株有代表性的C. glabrata菌株26S rRNA基因与FXY-4一起构建系统发育树，结果见图1。由图1可知，FXY-4与C. glabrata Y7_300（LC015357）、 C. glabrata HC07C（KJ624031）、C. glabrata HC10C （KJ624031）、C. glabrata T119-NL1（KF214423）、 C. glabrata ATCC 90030（KU729149）、C. glabrata ATCC 66032（KU729145）、C. glabrata ATCC MYA-2950（KU729136）、C. glabrata Y7_298（LC015355）、C. glabrata T118-NL1（KF214422）、C. glabrata CG1107（KM055440）、C. glabrata LMICRO529（KF746392）聚类在一个分支上且进化距离相同。由此可见，该菌株属C. glabrata，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2015664。

2.4 喂食富硒酵母FXY-4饲料对锦鲤体重与血清酶指标的影响

由表2、表3可知，喂养30 d后，低量添加富硒酵母飼料锦鲤体重比对照组提高17.8%，比抗生素组提高16.1%；高量添加富硒酵母饲料锦鲤比对照组提高19.9%，比抗生素组提高18.1%。在血清CAT活性上，低量添加富硒酵母饲料锦鲤体重比对照组提高62.5%，比抗生素组提高45.7%；高量添加富硒酵母饲料锦鲤比对照组提高127.1%，比抗生素组提高103.6%。在血清SOD活性上，低量添加富硒酵母饲料锦鲤比对照组提高31.7%，比抗生素组提高26.2%；高量添加富硒酵母饲料锦鲤比对照组提高34.5%，比抗生素组提高28.8%。

2.5 喂食富硒酵母FXY-4饲料对鱼肉中硒含量的影响

采用国家标准（GB 5009.93-2010）—原子荧光光度计法测定硒元素含量，测得高量添加富硒酵母饲料喂养的锦鲤鱼肉中硒含量为2.23 mg/kg，大于富硒食品硒含量0.20 mg/kg的标准。

3 小结与讨论

本研究从泡菜汁中分离了一株富硒酵母FXY-4菌株，利用分子生物学和生理生化方法鉴定其为光滑假丝酵母。菌体在0.5 g/L Na2SeO3的YEPD培养液中30 ℃培养24 h后，OD600 nm为5.3，菌体硒含量为0.54 mg/g（DW），在含硒培养基中生长快速且富硒能力强。将富硒菌株添加到饲料中喂食锦鲤，与对照组相比体重与血清酶指标均有明显提高。结果表明，该菌株具有较强的富硒能力，在鱼饲料中添加富硒光滑假丝酵母，可以增加鱼饲料中的有机硒，降低抗生素在饲料中的添加量，充分发挥富硒酵母增强免疫和促进生长的活性，强化动物饲料的营养价值，具有良好的市场前景。

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