炮制时间对何首乌16个成分含量变化影响的研究

赵梦杰　龚小红　党珏　袁岸　李燕　罗林　刘美辰　李芸霞

[摘要] 为研究48 h的炮制时间对何首乌中成分的含量及变化影响。采用HPLC测定22个不同炮制时间的何首乌对比市售制首乌中各成分的含量，并采用指纹图谱相似性分析和聚类分析对测定结果进行特征分析。结果显示，相似度均在0.9～1.0，各个样本之间有较好的相关性。聚类分析方法将22个制首乌和生首乌样品基本按成分变化特征聚为4类。该研究发现4～5 h为何首乌最佳炮制时间，为何首乌的质量控制以及深入研究提供参考依据。

[关键词] 何首乌； 炮制时间； 相似性分析； 聚类分析

Effect of processing time of Polygoni Multiflori Radix on

content changes of 16 componens

ZHAO Mengjie， GONG Xiaohong， DANG Jue， YUAN An， LI Yan， LOU Lin， LIU Meichen， LI Yunxia*

（The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine， State Key Laboratory

Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Cofounded by Sichuan

Province and Ministry of Science and Technology of the People′s Republic of China Pharmacy College，

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] To study 48 h processing time of Polygoni Multiflori Radix on its contents and changes of chemical components. HPLC was used to determine the contents of various components in 22 Polygoni Multiflori Radix samples with different processing time， and then the fingerprint similarity analysis and clustering analysis were used for characteristics analysis. Results showed that the similarity was between 0.91.0， with good correlation between the samples. In the clustering analysis， the 22 Polygoni Multiflori Radix and processed Polygoni Multiflori Radix samples were classified into 4 types according to the composition changes. The results demonstrated that 45 h was the best processing time， providing references for quality control and further study of Polygoni Multiflori Radix.

[Key words] Polygoni Multiflori Radix； processing time； similarity analysis； clustering analysis

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，制首乌为何首乌炮制品，性微温，味甘、涩，归肝、肾经，具有补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨、化浊降脂等功效，临床常用于治疗肝肾不足、精血亏虚、须发早白等[1]。近年来何首乌致肝损伤报道快速增长[23]，引起国内外的高度关注。古代强调何首乌“制非九次，勿寝其毒”，作为典型的生熟异治中药[4]，何首乌临床效用的安全发挥很大程度上受制于其炮制工艺的规范性与可靠性[5]。何首乌古代炮制强调九蒸九曝，而现代工艺已化简为仅蒸1次，这其中的差异环节是否为何首乌肝损伤事件增多的潜在原因？本文为建立和完善制何首乌质量评价标准，全面考察了不同炮制时间的何首乌中二苯乙烯苷类、游离蒽醌、结合蒽醌、以及其他主要成分的含量及其变化规律从而为确定何首乌合适的炮制时间提供参考，并期待建立何首乌炮制减毒工艺规范提供研究依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪器（泵G1312B，DEACB07224；进样器G1329B，DEAAC25245；柱温箱G1316A，DEACN27098；紫外检测器G4212BDEAA307363 美国Agilent公司）；KQ500DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sartorius 11D型電子分析天平（德国Sartorius公司）；隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）。

1.2 试药与试剂

没食子酸（批号150226），原花青素B1（批号140628），儿茶素（批号141224），没食子酸酯（批号140730），芦荟大黄素8OβD葡萄糖苷（批号141225），虎杖苷（批号141228），2，3，5，4二苯乙烯苷（批号141121），土大黄苷（批号141209），白藜芦醇（批号150122），大黄素8OβD葡萄糖苷（批号141209），大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷（批号150120），大黄酚（批号140325），纯度>98%，均购置于成都克洛玛生物有限公司。芦荟大黄素（批号MUST10112301），大黄酸（批号MUST11032801），大黄素（批号MUST12022715），大黄素甲醚（批号MUST12022005），纯度>98%，均购置于曼斯特生物科技有限公司。无水乙醇（批号20140928）购置于成都科龙化工有限公司。甲酸、乙腈均为色谱级，购于Fisher公司。其他试剂均为分析纯。

1.3 药材

生何首乌药材购置四川省巴中市药材市场，经成都中医药大学生药学研究室裴瑾教授鉴定为蓼科植物何首乌P. multiflorum的干燥块根。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

按《中国药典》2015年版规定，称取黑豆1.0 kg，10倍量水浸泡30 h后，加水煮约4 h，过滤，滤渣加8倍量水煎煮3 h后过滤，合并滤液，浓缩成约2.50 kg。

何首乌黑豆汁4∶1，取一定量大小相近的何首乌块，先用黑豆汁拌匀，隔水加热蒸制，分别于1，2，3，4，5，6，7，8，10，12，14，16，18，20，24，28，32，34，36，40，44，48 h分别取出适量何首乌块，晾晒至干，平行3份。各时间点炮制品以及同仁堂售制首乌分别打成粗粉备用。

精密称取各粗粉0.25 g，置具塞三角瓶中，加20倍量50%乙醇，浸泡30 min后，40 ℃下超声提取60 min，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液进样。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品没食子酸、原花青素B1，儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素8OβD葡萄糖苷、虎杖苷、2，3，5，4二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素8OβD萄糖苷、大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配置成质量浓度分别为131，98，185，142，78，125，5 400，142，94，750，86，71，81，500，25，88 μg·L-1的對照品储备液，4 ℃低温保存。

2.3 色谱条件

ZORBAX C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），ZORBAX C18预柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量5 μL； 流动相A为0.1%甲酸水，B为乙腈，梯度洗脱（0～5 min，5%～10% B；5～30 min，10%～22% B；30～38 min，22%～25% B；38～48 min，25%～32% B；48～55 min，32%～45% B；55～65 min，40%～85% B；65～70 min，85%～95% B；70～72 min，95% B）；检测波长275 nm。

2.4 数据分析

采用国家药典委员会推荐的中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件2004年A版进行各个炮制时间样品的相似度分析；采用SPSS 21.0 统计软件进行各个炮制时间样品进行系统聚类分析。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 何首乌各成分标准曲线制备 精密吸取何首乌16个对照品储备液适量，将对照品储备液进行梯度稀释，得到一系列浓度的标准溶液，按2.3项下的液相条件对各成分的峰面积进行测定，每个浓度平行进样3次，峰面积平均值为纵坐标，浓度为横坐标，计算得到各成分的标准曲线以及线性范围，结果见表1。

3.1.2 精密度 精密吸取没食子酸、原花青素B1，儿茶素、没食子酸酯、芦荟大黄素8OβD葡萄糖苷、虎杖苷、2，3，5，4二苯乙烯苷、土大黄苷、白藜芦醇、大黄素8OβD萄糖苷、大黄素甲醚8OβD葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚对照品，按照2.3项下色谱条件进行分析。考察各成分的日内精密度以及连续3 d的日间精密度，计算各成分的RSD，结果见表2。

由表2可知，各成分的日内以及日间精密度RSD均小于6.0%，仪器精密度良好。

3.1.3 重复性、稳定性以及回收率 取同一批生何首乌药材，按照2.1项下供试品溶液制备方法制备进样，进行重复性考察，各成分的RSD结果见表3；分别在0，3，6，9，12，24 h进样，考察样品稳定性，计算各成分的RSD结果见表3；取已知含量的样品，加入已知浓度的对照品适量，采用A=（A样+标-A样）/ A标×100%计算公式计算各成分的回收率，结果见表3。

由表3可知，何首乌各成分，RSD均小于5%，回收率值均在93.99%～107.7%，表明在该分析方法条件下各成分的重复性高，稳定性好，同时具有较好的回收率。

3.2 何首乌炮制前后成分的变化

取2.1项下的生何首乌以及21个不同炮制时

间的制首乌样品进行含量测定。每个样品重复测定3次，峰面积代入标准曲线方程进行计算，得到16种成分的含量，结果见表4。

3.3 构建对照指纹图谱

采用中药指纹图谱相似度评价系统研究版（2004年A版）对22个不同炮制时间的何首乌样品的指纹图谱进行相似度计算，采用中位数法，时间窗宽度为 0.2 min，获得对照图谱R和22个不同时间样本的色谱叠加图，见图1，计算机辅助相似度评价报告结果见表5。

通过中药指纹图谱的评价系统建立起来的对照指纹图谱与样品指纹图谱整体性（保留时间和峰面积）进行相似性比较，相似度一般在≥0.9认为符合要求。各炮制时间样本在一定的保留时间误差范围内（0.2 min）的都能与生成的对照指纹图谱有较好的重叠，各炮制时间的何首乌有较好的相似度。

3.4 聚类分析

采用SPSS 21.0 统计软件进行系统聚类分析，以中心质位数为组群合并准则，平方欧氏距离为度量，聚类结果见图2。结果显示何首乌不同炮制时间的样本共聚分为4类。

从图2看出，通过何首乌16种成分的聚类分析，基本反映不同炮制时间的何首乌成分变化特征。炮制时间为14，16，18，20，24，28 h的样本乌很好地聚为第一类；炮制时间为32，36，40，44，48 h的样本聚为第二类；炮制时间为4，5 h的样本聚为第三类；炮制1，2，3，6，7，8，10，12 h的样本聚为4类。结合何首乌成分含量分析，随着炮制时间的变化何首乌成分变化呈先增加后降低，随后趋于稳定的的变化趋势，炮制到4～5 h何首乌成分的含量达到最高值，随着炮制时间延长，成分含量呈现下降趋势，炮制到12 h后成分变化趋于稳定。

4 讨论

炮制时间的长短与何首乌的颜色有密切关系，炮制时间越长，颜色逐渐乌黑发亮，与相关报道一致[6]，其饮片外观和粉末颜色基本一致，表明炮制后饮片内外质量保持一致。

炮制时间对结合蒽醌类成分含量影响很大，结合蒽醌有很强的泻下作用，随着炮制时间的延长，其结合蒽醌含量明显降低，研究发现炮制约4～5 h时，结合蒽醌类成分降低幅度最大，为达到增效减毒的目的，初步将炮制时间设定4～5 h。与文献[7]取得类似结果，避免高温高压对何首乌药材成分产生较大影响，本文所述炮制方法与高压蒸制相比，更适用应用于临床。

[参考文献]

[1] 中国药典. 一部[S]. 2015： 175.

[2] 李春，苏晓，冯伟红，等.基于UPLCESIMS/MS的何首乌中12种真菌毒素污染检测[J].中国中药杂志，2016，41（23）：4368.

[3] 王伽伯， 肖小河， 杜晓曦， 等. 基于转化毒理学的中药肝损害客观辨识与早期诊断[J]. 中国中药杂志， 2014， 39 （1）： 5.

[4] 崔鹤荣， 柏兆芳， 宋海波， 等. 从古今炮制方法演变探讨何首乌都行的潜在影响因素[J]. 中国中药杂志， 2016， 41 （2）： 333.

[5] 马致洁， 李晓菲， 吕旸， 等. 基于干细胞毒性检测的何首乌炮制工艺比较研究[J]. 中国中药杂志，2015，40（12）：2325.

[6] 金嘉文， 陈有军， 刘梅， 等. 何首乌与制何首乌补血作用及HPLC指纹图谱的比较[J]. 中国实验方剂学杂志， 2013， 19 （8）： 206.

[7] 刘世琪， 王磊， 越亮. 高压炮制对何首乌中有效成分含量的影响[J]. 中国实验方剂学杂志， 2013， 19 （21）： 37.

[责任编辑 孔晶晶]