不同因素对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型效果的影响

宋 莹, 郭雅娟, 黄铭倩, 梁金强, 黄芝瑛

(中山大学 1. 实验动物中心; 2. 药学院, 广州 510006)

不同因素对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型效果的影响

宋 莹1, 郭雅娟2, 黄铭倩1, 梁金强1, 黄芝瑛2

(中山大学 1. 实验动物中心; 2. 药学院, 广州 510006)

目的 探究环磷酰胺(CY)剂量和检测终点对BALB/c小鼠免疫抑制模型效果的影响。方法 将BALB/c小鼠按照体质量随机分为对照组、CY 40 mg/kg组、CY 60 mg/kg组，此三组均设末次给药后第5日为检测终点，并设CY 60 mg/kg-2组，末次给药后第3日为检测终点，检测终点时进行血液学检查，测定脾脏、胸腺的脏器重量，检测T、B淋巴细胞介导的免疫功能改变。结果 与对照组相比，各模型组上述检测指标均有不同程度的改变; 比较各模型组结果，当检测终点相同时，60 mg/kg剂量造模效果更好; 固定CY剂量，选择末次给药第3日为检测终点效果更优。结论 CY剂量和检测终点的不同会影响BALB/c小鼠免疫抑制模型效果，选择60 mg/kg CY剂量的造模效果优于40 mg/kg; 末次给药后第3日更适合作为免疫评价模型的检测终点。

环磷酰胺(CY); 检测终点; 免疫抑制; 小鼠模型

目前市场上提高人体免疫力的保健品层出不穷，建立快速、灵敏的免疫抑制模型对药品、保健品的免疫学评价有重要意义。环磷酰胺(cyclophosphamide, CY)是一种烷化剂类化疗药物，临床上常用于抗肿瘤，此外CY还具有较强的免疫抑制作用，是制备免疫抑制模型常用的阳性药[1]。但是目前尚无较统一的免疫抑制模型造模条件，而条件设置对药品、保健品等的免疫学评价效果有明显影响。本文旨在探索CY剂量高低以及检测终点不同对免疫抑制模型效果的影响，为药品、保健品等的免疫学效果评价建立合适的模型提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级BALB/c小鼠32只，11～12周龄，雌雄各半，由广东省医学实验动物中心提供[SCXK (粤)2013-0002]。

1.2 药物、试剂与仪器

CY(批号04131204), 山西普德药业股份有限公司; 质量分数0.9%氯化钠注射液(批号B14070303),江西科伦药业有限公司; CD3e-PerCP(批号5079796)、CD4-FITC(批号5040579)、CD8a-PE(批号5047674)、CD19-FITC(批号5138957)、CD25-APC (批号5329646)、CD69-APC(批号3207812)、CD80-PE(批号3234833)、CD86-APC(批号4076926)、IFN-γ-APC(批号5245918)、IL-4-PE(批号 5119577)、Transcription Factor Buffer Set(批号5275574)、裂解液(批号 4189857)、细胞固定液(批号 4098726); Leukocyte Activation Cocktail(批号5215748)均为美国BD公司; 磷酸盐缓冲液(批号NAA1316)、胎牛血清(批号 NYB0814)，赛默飞世尔生物化学制品有限公司; RPIM-1640培养基(批号1687968)，美国life technologies公司; LPS(批号025M4040V)、Con-A(批号 SLBN0358V)，美国Sigma公司; CFSE细胞增殖荧光染料(批号 E10114-1641)，美国eBioscience公司; CCK-8法细胞增殖检测试剂盒(批号 20160325), 凯基生物技术有限公司。Accuri C6流式细胞仪, 美国BD公司; L535R-1型冷冻离心机, 湖南湘仪离心机仪器有限公司; Genius 3型漩涡混合器, 德国艾卡仪器设备有限公司; Ascent型多功能酶标仪，美国赛默飞公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组及给药 将BALB/c小鼠按体质量随机分为对照组、CY40 mg/kg组、CY60 mg/kg组以及CY60 mg/kg -2组, 每组8只, 雌雄各半。模型组均腹腔注射CY, 连续3 d，除CY60 mg/kg -2组为末次给药后第3日解剖测定各项指标外，其余3组为末次给药后第5日解剖测定各项指标。

1.3.2 指标测定 试验结束后测定动物的脾脏、胸腺系数[=脏器质量(g)/体质量(g)][2]。其余血液学及免疫学指标按试剂盒说明书进行。

1.4 数据分析

2 结果

2.1 60 mg/kgCY造模效果优于40 mg/kg剂量

两个剂量对BALB/c小鼠都可以造成免疫抑制，60 mg/kg CY组的造模效果更优。与对照组相比，60 mg/kg CY组胸腺和脾脏系数下降趋势更为明显(表1)。外周血中网织红细胞比例(RET%)、白细胞计数(WBC)和单核细胞比例(MONO%)显著降低(P＜0.05)(表2); NK细胞的活性明显受到抑制，脾B淋巴细胞的增殖速度也大大降低，且随着CY剂量增大降低幅度越大(表3)。

2.2 末次给药后第3日为检测终点优于末次给药后第5日

末次给药后第3日的60 mg/kg CY-2组脾脏受损更为严重(雌雄小鼠的胸腺和脾脏系数分别为0.170±0.030、0.186±0.027和0.189±0.012、0.156±0.021)。血常规结果也显示末次给药后第3日WBC[雌(3.47±0.48)× 109/L、雄(2.20±0.53) ×109/L]和RET%(雌0.31±0.03、雄0.43±0.02)下降更为严重。小鼠外周血中CD4+/CD8+比例在末次给药后第3日增长的程度更强，Th1、Th2细胞的比例则下降更为明显; 脾细胞悬液中T淋巴细胞的比例也显著上升，活化比例下降，但是B淋巴细胞的活化比例显著上升(表4)。

表 1 CY剂量不同对免疫抑制模型脏器系数的影响Table 1 The effect of different dosages of CY on immune organ coefficient of immunosuppressed mice model

表 2 CY剂量不同对免疫抑制模型血常规的影响Table 2 The effect of different dosages of CY on blood routine examination of immunosuppressed mice model

表 3 CY剂量不同对免疫抑制模型免疫细胞的影响Table 3 The effect of different dosages of CY on immunocytes of immunosuppressed mice model

续表3

表 4 末次给药后第3日为检测终点时免疫抑制小鼠模型的免疫细胞Table 4 The immunocytes of immunosuppressed mice model tested at 3 days after the last administration

3 讨论

胸腺和脾脏是重要的免疫器官，是淋巴细胞发育的重要场所，常被用于评价免疫功能强弱; RET是晚幼红细胞核脱核后到成熟的红细胞之间的过渡细胞，与红细胞免疫有密切的关系[3]，白细胞和单核细胞则是机体固有免疫的重要组成部分; NK细胞被认为是机体天然免疫的第一道防线，它是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁[4]; 在机体受到外来物质侵害时，T淋巴细胞能迅速增殖发挥免疫作用，因此T细胞的状态与免疫功能密切相关; CD4+CD25+Treg(regulatory T cells, Treg)免疫调节中发挥重要作用，能抑制T细胞和B细胞增殖，并抑制抗体的产生[5,6]，Foxp3为Treg细胞的特异性标志[7], CD4+Th 淋巴细胞按其所产生的细胞因子种类不同可以分为Th1和Th2 淋巴细胞, 其中IFN-γ促进Th 细胞分化为Th1, 主要参与细胞免疫; IL-4促进Th细胞分化为Th2，主要参与体液免疫[8]。本实验运用多个指标对免疫抑制的造模效果进行评估，例如脏器系数和血常规; 另外，运用流式细胞术检测外周血或脾脏各淋巴细胞分群和活化状态，该指标灵敏度高，代表性强，是反映机体免疫功能的首选。

CY和糖皮质激素类药物是免疫抑制模型常用阳性药物，各个药物的给药途径、给药剂量、给药周期均可影响免疫抑制模型的效果，宋雁等[9]比较了不同途径和剂量CY对模型的影响，该文建议一次性大剂量腹腔给予200 mg/kg CY造模。虽然不同的条件均可诱导免疫抑制模型，但是免疫抑制模型的应用是较为广泛的，而应用时对免疫抑制模型效果的要求也有所区别，本实验是基于本实验室前期保健品免疫功效评价中出现的问题, 即给药4周左右的小鼠用40 mg/kg CY剂量造模，末次给药后第5日检测时免疫抑制模型组与对照组较难出现免疫学指标的统计学改变，为此进行了本次探索。

在此类型评价中需要考虑到保健类药品在功效方面可能会弱于相应的药品，在造模时既要考虑到免疫抑制效果的出现，又不能严重地抑制动物的免疫功能而掩盖保健药物的潜在免疫调节作用。

综上所述，本实验结果证明了CY剂量以及检测终点的不同确实会对造模的效果产生影响。而对于保健品、食品等类型的免疫学评价中，经常会遇到给药一定周期如给药4周来观察药物对免疫系统的调节作用，此时在给药结束前使用CY造模时,本实验推荐选择60 mg/kg CY剂量连续给药3 d，其造模效果优于40 mg/kg; 末次给药后第3日更适合作为免疫学评价模型的检测终点。

[1] Pelaez B, Campillo JA, Lopez-Asenjo JA, et al. Cyclophosphamide induces the development of early myeloid cells suppressing tumor cell growth by a nitric oxide-dependent mechanism[J]. J Immunol, 2001, 166(11):6608-6615.

[2] 吕颖坚, 黄俊明, 蔡玟, 等. 环磷酰胺和氢化可的松建立免疫抑制模型方法比较[J]. 卫生研究, 2012, 41(6):951-955.

[3] 门剑龙. 测定自身免疫溶血性贫血患者未成熟网织红细胞指数的临床价值[J]. 临床检验杂志, 2004, 22(1):47-57.

[4] 杨颖, 蔡玟, 黄志彪, 等. 环磷酰胺致小鼠免疫功能低下模型建立与评价[J]. 中国公共卫生, 2008, 24(5):581-583.

[5] Ralainirina N, Poli A, Michel T, et al. Control of NK cell functions by CD4+CD25+regulatory T cells[J]. J Leukoc Biol, 2007, 81(1):144-153.

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[7] 王胜军, 许化溪, 杨胜利. CD4+CD25+调节性T细胞[J]. 细胞生物学杂志, 2005(27):61-65.

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[9] 宋雁, 贾旭东, 崔文明, 等. 不同途径和剂量环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型的对比研究[J]. 中国食品卫生杂志, 2013, 25(3):218-225.

Effect of Different Factors on Cyclophosphamide Induced Immunosuppression Mice Model

SONG Ying1, GUO Ya-juan2, HUANG Ming-qian1, LIANG Jin-qiang1, HUANG Zhi-ying2
(1. Laboratory Animal Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China; 2. School of Phamaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China)

Objective To investigate the different dosages of cyclophosphamide (CY) and endpointdetection on the effects of immunosuppression model. Methods BALB/c mice were divided into 4 groups randomly: negtive control group (A), CY 40 mg/kg group (B), CY 60 mg/kg group (C), which were all tested at 5 days after the last administration, and CY 60 mg/kg group-2 (D) was tested at 3 days after. The animal’s body weight was measured every day, hematological parameters and immune organ index were detected when the experiments finished, as well as immune function was mediated by T or B lymphocytes testing. Results The different doses of CY and endpoint-detection have impact on the immunosurpression effect. 60 mg/kg CY has stronger immunosurpression effect when tested at 5 days after the last administration. The alteration of immune indicators were more obervious when tested at 3 days after the last administration compared with 5 days at the dosage of 60 mg/kg CY. Conclusion Dosages of CY and endpoint-detection have impact on immunosuppressed mice model. 60 mg/kg CY is more effective than 40 mg/kg CY, and the results are better when 3 days after the last administration is chosen as the endpoint-detection.

Cyclophosphamide (CY); Endpoint-detection; Immunosuppression; Mice model

Q95-33

A

1674-5817(2017)01-0036-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.01.008

2016-08-19

宋 莹(1988-), 女, 硕士, 研究方向为药理及毒理学 。 E-mail:keaisongying@126.com

[通迅作者] 黄芝瑛, 教授。E-mail: hzhiying@mail.sysu.edu.cn