中渤海黑牛mtDNA cytb基因遗传多样性及亲缘关系分析

任艳玲 沈志强 马泽彬 李金林 肖 娜 董文艳 李忠顺王建军 杨占岗 刘吉山*

（①山东省滨州畜牧兽医研究院 256600 ②山东绿都生物科技有限公司 山东 滨州 ③山东无棣县车镇畜牧兽医站 ④山东省滨州市沾化区畜牧局 ⑤山东无棣华兴渤海黑牛种业股份有限公司 山东 滨州）

试验研究

中渤海黑牛mtDNA cytb基因遗传多样性及亲缘关系分析

任艳玲①沈志强①马泽彬④李金林①肖 娜②董文艳②李忠顺③王建军①杨占岗⑤刘吉山①*

（①山东省滨州畜牧兽医研究院 256600 ②山东绿都生物科技有限公司 山东 滨州 ③山东无棣县车镇畜牧兽医站 ④山东省滨州市沾化区畜牧局 ⑤山东无棣华兴渤海黑牛种业股份有限公司 山东 滨州）

为了了解无棣华兴渤海黑牛原种场渤海黑牛种公牛的遗传多样性水平，确定个体之间的亲缘关系，对无棣华兴渤海黑牛原种场15头渤海黑牛种公牛的细胞色素b基因(Cytb)全序列的测序和分析，发现Cytb基因全长1140bp，共检测到了10种单倍型、34个核苷酸的多态位点，包括15个单变异位点和19个简约信息位点，无插入和缺失。单倍型多样度(Hd)为0.914，核苷酸多样度(Pi)为0.01014，表明渤海黑牛具有丰富的遗传多样性。NJ系统发育树构建的结果表明15头渤海黑牛聚为两大类。

渤海黑牛 线粒体DNA cytb基因 遗传多样性 亲缘关系

渤海黑牛(Bohai Black Cattle)原称“无棣黑牛”、又称“抓地虎黑牛”，是我国唯一的黑毛黄牛品种，是世界上三大黑毛牛种之一，也是我国八大优良地方黄牛品种之一。以被毛、口轮、蹄冠、角、鼻镜全黑，低身广躯而闻名，它具有体型结构良好，育肥性能好、屠宰率高等特点。优良的肉用性能可以和国外著名肉牛品种相媲美，尤其肉色鲜艳，脂肪雪白并分布均匀，大理石花纹明显，烹调后香味浓郁为其它品种所不及，活牛及牛肉行销香港，素有“黑金刚”的美誉。

渤海黑牛主要产地为山东省滨州市渤海一带的无棣、沾化、阳信、惠民等县。在山东省东营市、潍坊市、淄博市、德州市以及河北省沧州市也有分布，但数量较少。目前，尤以无棣县存栏量为最多，质量最好。20世纪的黄牛改良和肉牛改良，给渤海黑牛这一品种带来很大的冲击，中心产区存养量急剧下降，分布范围日渐缩小。特别是进入21世纪以来，随着农业机械化水平的不断提高，渤海黑牛在农业生产中的优势日趋淡化，再加上养殖成本的增加，农户不再从事渤海黑牛的养殖繁育工作，致使渤海黑牛濒临绝种。为保护渤海黑牛这一畜禽遗传资源，2002年滨州市畜牧兽医局组建了山东省渤海黑牛原种场，2008年被国家农业部批准为“国家级渤海黑牛保种场”。2011年10月，迁址到无棣县车镇山东无棣华兴渤海黑牛种业股份有限公司，新建牛场位于县城以北20公里处，靠近大义路，占地203亩。现存栏渤海黑牛600头，其中基础母牛570头，种公牛30头。无棣县以山东省渤海黑牛原种场为依托，充分发挥渤海黑牛原产地优势，在碣石山、柳堡和车王等三个乡镇建立了渤海黑牛保护区。2008年被认定为“国家级畜禽遗传资源保

护区”。目前保护区内渤海黑牛存栏量3000余头。配种用冻精全部来自于山东省渤海黑牛原种场，保证了渤海黑牛的纯种繁育。线粒体Cytb基因是线粒体中重要的蛋白编码基因，包含从种内到种间乃至到科间的进化遗传信息，在系统进化和分类研究中有着较强的适用性，被广泛应用于家畜起源进化、亲缘关系和群体遗传结构研究[1,2]。本研究旨在分析华兴渤海黑牛原种场内的15头种公牛的线粒体DNA的遗传多样性和亲缘关系，为渤海黑牛保种育种资源保护提供理论技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验动物、基因组DNA的提取 15头渤海黑牛血样，采自无棣华兴渤海黑牛原种场。颈静脉采血，ACD抗凝，全血基因组试剂盒(Takara，Code D9081)提取基因组DNA，-20℃保存备用。

1.2 引物设计 根据Genbank中(EU177868.1)发布的牛Cytb基因序列设计一对引物，引物序列为：P1：5’TGAAAAACCATCGTTGTCAT 3’，P2：5’CAAAGACCT GTCTTCATTTTAGT 3’。

1.3 渤海黑牛Cytb基因扩增及测序 PCR反应体系：10×PCR buffer 2.5μl，dNTP 1.5μl，上下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板DNA 1μl，加H2O至总体积25μl；PCR反应程序：95℃预变性5min，95 30s℃ ，59 30s℃ ，72 30s℃ ，循环29次，70℃延伸10min。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测其片段大小与浓度，试剂盒纯化回收，由上海生工生物技术服务有限公司进行测序。

1.4 数据处理 应用ClustalX(1.83)软件进行多序列比对，通过DnaSP5.0软件分析渤海黑牛15条Cytb序列的变异位点及单倍型。用MEGA5软件构建渤海黑牛种公牛的亲缘关系聚类图。

2 结果

2.1 渤海黑牛线粒体DNA cytb基因序列 通过克隆测序，获得15条渤海黑牛线粒体Cytb基因全序列，全长均为1140bp，共检测到34个突变位点，约占核苷酸总数的2.98%，其中包括15个单变异位点和19个简约信息位点，无插入和缺失。15条序列共检测到10种单倍型，单倍型多样度Hd为0.914，核苷酸多样度Pi值为0.01014。

表1 Cytb基因各单倍型变异位点

表2 Cytb基因单倍型的多样性参数

2.2 mtDNA Cytb基因核酸组成 利用MEGA5.0基因序列平均核苷酸组成，结果见表3。渤海黑牛Cytb基因全序列平均碱基含量为T25.3%，C30.0%，A31.3%，G13.4%。其中G的含量低于其它碱基含量。A+T含量(56.6)高于G+C含量(43.4%)，这与动物mtDNA富含AT的结论一致。

表3 Cytb基因序列平均核苷酸组成

2.3 渤海黑牛种公牛亲缘关系聚类图 用分子进化遗传分析软件MEGA5选用Kimura双参数模型计算15个种公牛之间的平均遗传距离，见表4。15个个体间遗传距离为0～0.021，平均值为0.012。引用野牦牛Cytb序列(AY955226)做外群，构建了渤海黑牛15个个体、NJ系统发育树(附图)，由图可知，15头种公牛聚为2大类。

表4 渤海黑牛15 个个体之间的Kimura 双参数遗传距离

附图 用NJ 法构建的渤海黑牛15 个个体间的聚类图

3 讨论

3.1 渤海黑牛的遗传多样性研究 从分子水平上分析地方品种的遗传多样性和群体遗传结构是实施保护和利用的基础，近年来学者对渤海黑牛开展了一些研究。王建英等[3]在渤海黑牛和日本和D-loop区遗传变异研究中发现，渤海黑牛mtDNA D-loop区具有丰富的遗传多样性，二者的亲缘关系很近；渤海黑牛含有普通牛和瘤牛的血统、受到过瘤牛血缘渐渗的影响。周芬娜等[4]和王敏强等[5]分析了渤海黑牛和鲁西黄牛的遗传多样性，均表明渤海黑牛有丰富的遗传变异，但是群体遗传多样性低于鲁西黄牛。但是对渤海黑牛Cytb基因遗传多样性尚未见报道，本研究通过对渤海黑牛mtDNA cytb基因分析，15个渤海黑牛个体单倍型多样度Hd为0.914，核苷酸多样度Pi值为0.01014，亦具有丰富的遗传多样性。

3.2 渤海黑牛种公牛亲缘关系与保护建议 15个渤海黑牛个体间的遗传距离为0～0.021，平均遗传距离为0.012，说明个体之间亲缘关系较近。因此应该多渠道、多投入，加强品种保护和利用。（1）渤海黑牛的品种资源保护和开发利用是一项高投入、长时间的系统工程，一方面需要政府加大投入资金，另一方面需要积极吸引社会资金，鼓励企业和个人及有关社会团体参与。（2）扩大保种群的数量，饲养一定数量的公牛和采取合理的公母比例，以维持渤海黑牛群体内的遗传多样性。（3）适当的导入外血，通过导入优势基因，在保护遗传多样性的同时提高生产性能。

[1] 蔡欣, 陈宏, 雷初朝等. 中国3个牛种Cytb基因多态性及其系统发育研究[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2007, 35(2): 43-46.

[2] IRWIN D M，KOCHER T D，WILSON A C．Evolution of the eytochrome b gene of mammals[J]. Journal of Molecular Evolution, 1991, 32(2): 128-l44.

[3] 王建英, 张秀美, 兰邹然等. 渤海黑牛和日本和牛mtDNA D-loop区遗传变异研究[J]. 中国农业大学学报, 2009,14(3): 75-82.

[4] 周芬娜, 毕伟伟, 王慧等. 鲁西黄牛和渤海黑牛群体遗传多样性的RAPD分析[J]. 山东畜牧兽医, 2010, 31: 1-2.

[5] 王敏强, 李丽萍, 陈礼学等. 用20个微卫星标记研究鲁西黄牛和渤海黑牛的遗传多样性[J]. 河北农业大学学报, 2006, 29(6): 75-81.

S823.2

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1007-1733(2017)05-0001-02

2017–01–11）

*通讯作者