超声引导下细针穿刺联合细胞蜡块免疫组化及基因检测在诊断肺癌锁骨上淋巴结转移中的价值

田海英 徐海苗 杨琛 赵惠琤 王立平 徐栋

·经验交流·

超声引导下细针穿刺联合细胞蜡块免疫组化及基因检测在诊断肺癌锁骨上淋巴结转移中的价值

田海英 徐海苗 杨琛 赵惠琤 王立平 徐栋

目的探讨超声引导下细针穿刺联合细胞蜡块免疫组化及基因检测对老年肺癌锁骨上淋巴结转移患者的临床应用价值。方法选取85例肺癌锁骨上淋巴结转移患者（共95个淋巴结），采用超声引导下细针穿刺获得标本，行细胞学涂片检查，同时制作细胞蜡块行免疫组织化学和基因检测。结合随访结果分析两种检查方法的临床应用价值。结果85例患者共穿刺95个淋巴结，超声引导细针穿刺诊断淋巴结阳性率为44.8%（30/67），组织学正确分类比例为37.3%（25/67），淋巴结阴性率为55.2%（37/67），穿刺成功率为70.5%（67/95）。联合细胞蜡块切片行免疫组织化学检查后，淋巴结阳性率为77.4%（72/93），组织学正确分类比例为59.1%（55/93），淋巴结阴性率为22.6%（21/93），穿刺成功率为97.9%（93/95）。两种方法比较差异有统计学意义（P＜0.05）。37例肺腺癌细胞蜡块样本中22例行表皮生长因子受体基因突变检测，16例突变阳性，突变率72.7%。结论超声引导下细针穿刺联合细胞蜡块免疫组化诊断肺癌锁骨上淋巴结转移简单实用，可提高临床诊断准确率。

超声检查；肺癌；锁骨上淋巴结；细胞蜡块；组织学

肺癌是目前危害人类健康最常见的恶性肿瘤，其中80%～90%为非小细胞肺癌［1］，而锁骨上淋巴结转移是肺癌常见的转移方式。肺癌发生锁骨上淋巴结转移被认为是N3期，外科手术的远期获益不明显［2］。目前临床上有部分患者在原发灶病理组织获取方面出现困难，主要原因是病灶较小或位置靠近肺组织外周，纤支镜或CT定位下难以获取有效组织成分，从而无法进行免疫组化和基因检测。对于这部分患者如发现有锁骨上淋巴结转移，则可在超声引导下行细针穿刺并制作细胞蜡块。本研究通过在超声引导下行锁骨上淋巴结细针穿刺并制作细胞蜡块，结合免疫组化和基因检测，探讨其对肺癌锁骨上淋巴结转移的临床价值。

资料与方法

一、临床资料

选取2014年1月至2016年4月浙江省肿瘤医院收治的85例肺癌患者，其中男63例，女22例，年龄49～85岁，平均（62.68±9.13）岁，60岁以上老年患者占76.5%，所有患者临床病理资料完整。85例患者共95个淋巴结，结节最大直径为4～19mm，平均（8.19±3.18）mm。

二、仪器与试剂

1.仪器：使用GELogiq E 9彩色多普勒超声诊断仪，9L-D线阵探头和ML6-15D探头，频率9～15MHz。

2.试剂及抗体：免疫组织化学染色的相关抗体购自上海基因公司。表皮生长因子受体（EGFR）试剂盒购自厦门艾德公司。

三、方法

1.细针穿刺：患者去枕取平卧位，对锁骨上可疑转移性淋巴结行多轴位扫查，确定结节大小，选择进针位置。常规对锁骨上区域局部皮肤进行消毒后，在超声引导下避开大血管、气管及周围神经等重要组织，沿淋巴结长轴经皮刺入淋巴结皮质内，保持针管内持续负压，反复旋转抽吸并进行多点多方向提插，抽取10～15次，直至所需标本进入针头柄及针管后去负压退针（图1）。

图1 超声引导下细针穿刺示意图

2.涂片制作及细胞学诊断：将针管内的穿刺标本均匀涂布于载玻片上，立即置入95%乙醇，固定15min后行常规巴氏染色，显微镜下观察并做出细胞学诊断。

3.细胞蜡块制作：将针管内剩余样本注射至10%中性福尔马林10m l中固定30～60min以上，2000 r/min，离心5m in，沉淀后弃上层清液，沉淀物琼脂凝集成块，滤纸包裹，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，厚4μm连续切片10张以上行HE染色并在显微镜下观察［3］。

4.免疫组织化学染色：每例样本的细胞蜡块切片同时进行ALK（D5F3）（＋）、ALK-NC（-）、ROS1（-）、c-Met（＋＋，80%）、CK7（＋）、Napsin A（＋）、P40（-）、P63（-）、TTF1（＋）及CK5/6（-）等10项免疫组织化学染色，采用Lab Vision公司生产的Labvision Autostainer720型自动免疫组织化学染色，Envision法，处理过程与一般的组织学检查相同［3］。

5.EGFR检测：确认为肺腺癌的细胞蜡块样本采用突变特异性扩增系统荧光聚合酶链反应法进行EGFR基因突变的检测。

四、统计学处理

应用SPSS13.0统计软件，率的比较行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、穿刺时间和并发症情况

所有患者均穿刺成功，穿刺时间不超过10min，未出现血肿、感染、食管气管损伤及神经损伤等并发症。

二、超声引导细针穿刺与联合细胞蜡块免疫组化诊断结果比较

95个淋巴结超声引导细针穿刺常规涂片及联合细胞蜡块诊断结果比较见表1和图2。其中，常规涂片取材成功67个，超声引导细针穿刺诊断淋巴结阳性率为44.8%（30/67），组织学正确分类比例为37.3%（25/67），淋巴结阴性率为55.2%（37/67），穿刺成功率为70.5%（67/95）。超声引导联合细胞蜡块取材成功93个，免疫组织化学检查后，淋巴结阳性率为77.4%（72/93），组织学正确分类比例为59.1%（55/93），淋巴结阴性率为22.6%（21/93），穿刺成功率为97.9%（93/95）。两种方法比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 肺腺癌锁骨上淋巴结转移细针穿刺病理图

三、细胞蜡块EGFR基因检测

本研究22例确诊为肺腺癌病例的细胞蜡块切片采用突变特异性扩增系统法行EGFR基因突变检测，其中16例突变阳性，突变率72.7%。EGFR突变阳性患者均采用靶向药物治疗。

讨论

目前组织学检查虽然是锁骨上淋巴结病变公认的诊断标准，但多需采用外科手术切除或粗针穿刺获取组织学标本［4］，对锁骨上淋巴结的初始诊断而言，患者难以接受。为解决这一问题，本院超声科开展了超声引导下细针穿刺联合细胞蜡块免疫组化检查。

常规超声引导下淋巴结穿刺活检在诊断淋巴结疾病中有着重要作用，超声定位引导穿刺活检可实时监控穿刺针头，避开重要血管和神经组织，具有安全、微创及可重复性高的特点［5］。有研究［6］显示，超声联合超声定位引导穿刺活检对腋窝淋巴结转移的准确性和特异性均较高。在超声引导下，穿刺针可对常规超声认为可疑的肿大淋巴结进行标本采集，并可根据标本质量实时调整穿刺次数，为诊断提供更多信息。同时穿刺操作者可通过二维超声选择最佳进针路径，并在穿刺过程中尽量避开大血管和神经，减少对组织的损伤，以及大出血等并发症的发生，较外科手术切除或粗针穿刺创伤更小，降低了操作难度，有利于临床推广应用。

细胞蜡块免疫组化检查是一种介于涂片细胞学和病理组织学之间的一种有效的临床诊断方法［7－9］，利用细针穿刺标本呈现局部组织病理学形态，细胞蜡块切片中细胞数量丰富而且相对集中，为进行免疫组织化学染色后分子病理学检测提供了良好的样本平台。近年来，许多获批的抗癌药物均为靶向治疗药物，在给药前对患者进行特定基因突变的筛查，能够使部分患者获得最大的治疗益处。而目前临床对于肺癌选择用药的重要依据是明确组织学类型，尤其是区分小细胞肺癌和非小细胞肺癌。对于非小细胞肺癌临床要求进一步区别鳞癌和腺癌，并提供与药物使用相关的分子病理学检测结果，然而目前超过70%的肺癌确诊依赖小活检和细胞学样本［10－11］。本研究对85例临床怀疑肺癌却无法获取原发灶组织病理的患者在超声引导下行锁骨上可疑肿大淋巴结细针穿刺，结合细胞蜡块免疫组化做出了明确诊断及分型，避免了更高风险的其他侵袭性活检，必要时对部分患者进行了EGFR基因检测，为临床的靶向治疗及预后评估等方面提供了依据。

本研究显示应用超声引导下细针穿刺联合细胞蜡块免疫组化及基因检测有较高的临床推广价值：①超声引导下细针穿刺在一定程度上有效避免了高风险的侵袭性活检及不必要的外科手术，对大血管周围或1 cm以下的转移淋巴结更具优势；②超声引导下穿刺具有微创、可重复取样的优点，适用范围广，尤其适用于晚期老年患者，对于气道阻塞及上腔静脉综合征引起端坐呼吸的患者同样适用；③随着临床需求不断提高，如精确定性分型、药物敏感及预后相关性的各类分子检测项目的广泛应用，细针穿刺结合细胞蜡块技术逐渐成熟和广泛应用；④超声引导下细针穿刺联合细胞蜡块可最终明确病理诊断和疾病分期，为制定治疗方案及评估预后提供了依据，提高了临床的治疗水平。

综上所述，超声引导下的多点多方向针吸细胞学检查诊断准确率高、安全性好，穿刺靶点、穿刺针及血管在超声图像下可清晰显示，对于明确颈部肿大淋巴结性质有重要的应用价值，可作为诊断的首选方法。超声引导下细针穿刺联合细胞蜡块免疫组化不仅为临床提供诊断依据，更为临床的靶向治疗及预后评估等方面提供了有力证据。

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V alue of ultrasound－guided fine－needle aspiration cell blocks immunohistochem istry and gene detection in diagnosis of metastatic supraclavicular lym ph nodes in lung cancer

TIANHaiying，XUHaimiao，YANGChen，ZHAOHuicheng，WANGLiping，XUDong
DepartmentofUltrasound，t he Second ClinicalMedicalCollege，Zhejiang ChineseMedicalUniversity，Hangzhou 310053，China

ObjectiveTo investigate the clinical value of ultrasound－guided fine－needle aspiration combined with cell block immunohistochemical and gene testing in the elderly patients with supraclavicular lymph nodemetastasis of lung cancer.MethodsEight-five patientswith supraclavicular lymph nodemetastasis of lung cancerwere collected（95 lymph nodes）.Using ultrasound－guided fine－needle aspiration，the specimenswere obtained cytological smears，and alsomade into cell block for immunohistochemical and genetic testing.Combined with follow－up results，the diagnosis of cytological smearsand cell block immunohistochemicalwere retrospectively analyzed and compared.ResultsA total of 95 lymph nodeswere punctured in 85 patients，the positive rate of lymph node s diagnosis was 44.8%（30/67）by ultrasound-guided fine-heedle aspiration，histological correct classification ratewas37.3%（25/67），the negative rate of lymph node s was55.2%（37/67），and the success rateofpuncturewas70.5%（67/95）.Combinedwith immunohistochemistry，the positive rate of lymph node s diagnosis was77.4%（72/93），the histological correct classification rate was 59.1%（55/93），the negative rate of lymph node s was 22.6%（21/93），and the success rate of puncture was97.9%（93/95）.The differencebetween the twomethodswasstatistically significant（P＜0.05）.37 casesof lung adenocarcinoma cellblock samples in 22 casesof EGFR genemutation detection，16 cases ofmutation－positive，mutation rate was 72.7%.ConclusionThe diagnosis of supraclavicular lymph nodemetastasis in lung cancer is simple and practicalunder the ultrasound－guided fine－needleaspiration combined with cellblock immunohistochemical.Italso can improve the clinicaldiagnosis rate.

Ultrason ography；Lung cancer；Supraclavicular lymph node s；Cellblock；Histology

R734.2；R445.1

A

2016-07-16）

310053杭州市，浙江中医药大学第二临床学院超声医学科（田海英）；浙江省肿瘤医院病理科（徐海苗），超声科（杨琛、赵惠琤、王立平、徐栋）

徐栋，Email：xudnj＠163.com