李景涛 ,刘英军 ,解小锋 ,段春玲 ,赵文超 ,沈善超 ,周彩琴 ,范志强 *
(1.山东省林木种苗和花卉站,山东 济南250014;2.山东省经济林管理站;3.诸城市万景源农业科技有限公司)
L35杨为欧美杨,雌株,干直,抗逆性强,适应范围广,育苗及造林成活率高,速生。杨树作为我省人工栽培面积最大的树种,目前普遍出现了种质退化以及病毒病严重的情况,造成这一现象最重要的原因是以苗繁苗、繁育种苗所用的种条老化,病毒积累严重,造成种条质量差。利用微体快繁技术,可部分脱去病毒,使杨树良种复幼复壮,利用组培苗建设标准化采穗圃,用采穗苗的种条做为繁殖材料来建设良种繁育圃,可提高种苗的质量,对于推动良种的产业化健康发展具有重要意义。
供试品种为L35杨,取春季大田生长的顶芽和带腋芽的茎段作为外植体。
1.2.1 无菌体系的建立和外植体的诱导
取带腋芽的茎段,剪去叶片,留叶柄基部,用流水冲洗干净,在超净工作台上,用75%的酒精浸30秒,根据材料的幼嫩程序,0.1%的升汞溶液处理7~15min、无菌水冲洗5遍。切取顶芽和茎段接种到1/2MS空白培养基中。培养条件:温度25℃,光照度2000~2500LX,光照每天12小时。
1.2.2 分化培养基的筛选
基本培养基为MS附加3%蔗糖,激素采用三因素 (6-BA,GA3,NAA,), 三水平 (6-BA 0.05、0.1、0.15 mg/L ;GA3 0、0.1、0.2 mg/L ;NAA 0.01、0.02、0.03 mg/L)的正交实验设计,以分化系数为主要观测指标,同时观测愈伤组织的大小。实验设计如下表
表1 不同浓度激素对L35杨试管苗增殖影响正交实验设计L9(33)
切取诱导培养形成的顶芽和腋芽,切取2~3cm的嫩梢,转入上述9种不同培养基中,每个组合25株,培养条件同上,培养25天后统计实验结果。
1.2.3 生根培养基的筛选
基本培养基为1/2MS附加2%蔗糖,添加不同浓度 IBA(0.1、0.5、1.0、2.mg/L),研究单一生长素 IBA对生根率和愈伤情况的影响。
从继代MS培养基中选取发育正常的长2.0cm以上的新梢作为生根材料,插入上述生根培养基中。每种处理25株生根苗,培养条件同上,观察统计生根率和愈伤组织状况。
实验结果表明:L35杨外植体最适升汞处理时间为9min,经升汞表面消毒转到1/2MS空白培养基中,平均污染率为75%。成活的外植体在培养基中培养7~9天后,顶芽开始生长,腋芽萌动,20天后长成2cm左右的嫩梢。
外植体在9个分化培养培养基中培养10天左右均开始诱导出不定芽,25天后各组合均诱出不定芽和愈伤组织,具体结果如表2:
表2 不同浓度激素对L35杨试管苗增殖影响结果
通过对实验结果的统计分析表明:L35杨试管苗理论最适分化培养基为:MS+6-BA0.15mg/L+NAA0.03mg/L,与组合7相同,分化系数可达到4.6,愈伤组织偏大。实际最适分化培养基为MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L,分化系数可达4.0,愈伤组织大小适中。同时通过极差分析,三种激素对对L35杨试管苗分化的影响程度为 6-BA>NAA>GA3,6-BA对L35杨的分化系数影响最大。
鉴于在实际生产中,愈伤组织偏大会造成基部易褐化,在接种时会造成较大的工作量,因而在实际生产上采用的分化培养基为:MS+IBA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+3%蔗糖。通过连续的分化培养,验证分化培养基的稳定性。
表3 不同IBA浓度对L35杨试管苗生根的影响
接种到上述四种生根培养基中小苗培养15天左右长出放射状不定根,20天后统计4个组合的生根率,结果如表3:
由上述实验结果可知,L35杨的生根对IBA的反应较为敏感,四个不同浓度处理生根率均较高,但愈伤都较大,不利于驯化。根据这一实验结果,将IBA 的浓度降为(0.01、0.02、0.05mg/L)三个梯度,以0.1做对照。实验结果如下:
表4 低浓度IBA对L35杨试管苗生根的影响
实验结果表明:L35杨试管苗最适生根培养基为1/2MS+IBA0.02mg/L+2%蔗糖生根率为97.22%,诱导的根系较多,呈白色放射状,愈伤大小合适,长势良好,驯化后成活率高。
本实验通过对L35杨微体快繁体系的研究,确定了最佳分化培养基为MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.02mg/L+3%蔗糖,分化系数为4.0,分化系数较高,分化苗生长势较好,愈伤适中。最适生根培养基为1/2MS+IBA0.02mg/L+2%蔗糖 ,生根率为97.22%,生根率较高,生根质量好,根系呈放射状,愈伤组织小,有利于驯化成活。L35杨微体快繁体系的建立,为L35杨的工厂化和规模化育苗打下了基础。