南方水稻黑条矮缩病毒P8蛋白的定位和致病性分析

陶亚群，彭小琴，李佩，王浩然，李聪，鲁红雪，章松柏(长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

吴祖建 (福建农林大学植物病毒研究所，福建 福州350002)

南方水稻黑条矮缩病毒P8蛋白的定位和致病性分析

陶亚群，彭小琴，李佩，王浩然，李聪，鲁红雪，章松柏
(长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

吴祖建
(福建农林大学植物病毒研究所，福建 福州350002)

P8是南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)编码的一种外壳蛋白，该蛋白的其他功能未知。利用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)异源病毒载体和pEarleyGate101在本氏烟(Nicotianabenthamiana)中表达了P8，通过荧光共聚焦显微镜观察这些蛋白的亚细胞定位情况，分析该蛋白的表达对本氏烟的影响。 结果显示：P8主要定位于细胞质，在细胞质中形成颗粒状聚集体；与PVX空载体侵染的本氏烟相比，P8蛋白的表达能够促使本氏烟表现出一定程度的花叶和新叶皱缩症状，推测可能参与病毒的致病性过程。

南方水稻黑条矮缩病毒；结构蛋白；致病性；亚细胞定位

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)最早由周国辉等在水稻上发现并命名的一种新的植物呼肠孤病毒[1～4,8]。该病毒主要由迁飞性害虫白背飞虱以持久性方式进行传播[5～7]，可以寄生危害水稻、玉米、高粱等多种禾本科作物及杂草[2,8,9]，因其在粮食生产上造成的巨大损失，引起了各国家学者的高度关注[10～13]。自病毒发现以来，广东、广西、湖南、云南、海南、湖北、安徽等地分离株的基因组相继被测定[4,14,15]，一些病毒编码的蛋白功能也逐渐被揭示，如Pns6为病毒的基因沉默抑制子[16]；Pns71形成管状蛋白[17]；Pns91为基质蛋白，与病毒的复制密切相关[18]，而且Pns51和Pns6互作在病毒基质的形成中起重要作用[19]，Pns51、Pns6和Pns91对于病毒粒子和纤维丝状结构域的形成起关键作用[19,20]。

蛋白质的功能与其亚细胞位置有着密切的联系，病毒蛋白只有在细胞内正确定位才能发挥其正常的生物学功能，在寄主植物上表现不同的症状。如RSV CP和NSvc4蛋白定位于叶绿体中[21]，RSV CP在本氏烟中引起叶片的褪绿形成花叶症状，在发病水稻中CP在叶绿体中的积累量与水稻叶片的褪绿成正相关，被认为引起水稻叶片条纹症状[21,22]；SRBSDV Pns92分散于整个细胞，定位于细胞质中或膜上，形成丝网状结构[23]，Pns92引起本氏烟叶片沿叶脉处形成浓绿，而SRBSDV在水稻叶片上引起浓绿症状，这与Pns92在本氏烟引起的沿叶脉处浓绿症状相一致，推测Pns92可能与病毒的致病性相关[24]等等。

P8是南方水稻黑条矮缩病毒编码的一种外壳蛋白，而该蛋白的其他功能未知。本研究利用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)异源病毒载体和pEarleyGate101在本氏烟中表达P8，通过荧光共聚焦显微镜观察该蛋白的亚细胞定位情况，分析P8的表达对本氏烟影响，为SRBSDV病毒蛋白的功能及致病性研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料、菌株和载体

SRBSDV侵染的水稻材料于2009年9月采集于湖北省公安县发病田间，本氏烟为长江大学农学院病毒学实验室自留种保存，2种植物材料均种植于该实验室光照温室中；农杆菌EHA105为长江大学农学院病毒学实验室保存菌株，大肠杆菌DH5( 感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司；克隆载体pMD 18-T购自Takara公司；致病性分析使用的马铃薯X病毒载体由浙江大学周雪平老师课题组惠赠，阳性对照PVX-RSV-CP(水稻条纹病毒(Rice stripe virus)的外壳蛋白)重组载体和定位载体pEarleyGate101由福建农林大学魏太云老师课题组惠赠，其它相关试剂皆购自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法1.2.1 PCR扩增和实时定量PCR引物设计

根据SRBSDV湖北分离物序列(S10-S1，登陆号为：HM585270-HM585879)，设计用于扩增病毒P8基因的含酶切位点和重组位点的引物见表1。

表1 用于病毒基因片段扩增的引物

1.2.2 PVX重组载体的构建和农杆菌转化

通过RT-PCR获得病毒相关基因的PCR产物并回收，重组至克隆载体pMD 18-T中，测序验证正确后通过酶切连接构建重组终载体PVX，标记为PVX-P8。将重组植物表达载体导入农杆菌，农杆菌转化按照文献[25]的方法进行，最后通过菌落PCR鉴定重组农杆菌。

1.2.3 pEarleyGate101重组载体的构建和农杆菌转化

通过RT-PCR获得病毒相关基因的PCR产物并回收，重组至克隆载体pMD 18-T中，测序验证正确后通过酶切连接构建重组终载体pEarleyGate101，标记为YFP-P8。将重组植物表达载体导入农杆菌，农杆菌转化按照文献[25]的方法进行，最后通过菌落PCR鉴定重组农杆菌。

1.2.4 农杆菌侵染本氏烟

取健康的本氏烟叶片，参照Sparkes等[26]的方法进行农杆菌侵染本氏烟试验：注射含有PVX空载体(阴性对照)、PVX-RSV-CP(阳性对照)、PVX-P8、pEarleyGate101(空)和YFP-P8等重组农杆菌到本氏烟叶片，然后进行致病症状和蛋白亚细胞定位观察，每个样品处理每次注射3～5 株，试验重复3 次，致病性观察于处理后第5、9、15d记录症状表现，亚细胞定位观察于处理后48h进行。

2 结果与分析

2.1 病毒基因植物表达载体的构建

利用表1中病毒基因的引物扩增SRBSDVP8基因的全长，琼脂糖凝胶电泳检测及测序结果表明扩增产物的大小与所测定的SRBSDV湖北分离物相应基因序列的大小一致。克隆后，通过酶切将其连接到pEarleyGate101载体上。最后质粒测序结果表明，成功构建了病毒P8结构蛋白的荧光定位载体，并携带YFP黄色荧光蛋白序列，标记为YFP-P8。

2.2 P8在本氏烟细胞中的定位

将构建好的P8基因重组荧光定位终载体转化到农杆菌EHA105中，通过烟草瞬时表达体系表达P8和YFP的融合蛋白，激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白黄色荧光在细胞中的分布，结果如图1。对照YFP定位于细胞核和细胞质，P8主要定位于细胞质，在细胞质中形成颗粒状聚集体。

标尺：100μm ；Chl：叶绿体图1 P8蛋白的亚细胞定位

2.3 P8能引起花叶症状

借助重组农杆菌介导,(重组)PVX侵染本氏烟试验结果显示：供试本氏烟在5d左右开始发病，9d左右症状趋于稳定(图2，白色方框示系统叶症状表现)，15d后绝大多数本氏烟症状逐渐消失；阴性对照PVX空载侵染后形成轻微的花叶，阳性对照PVX-RSV-CP的系统叶表现出典型花叶症状(图2-B)，与PVX空载体侵染的本氏烟相比，P8的表达能够促使本氏烟表现出一定程度的花叶和新叶皱缩症状，推测可能参与病毒的致病性过程。

图2 SRBSDV P8的致病性鉴定

3 讨论

细胞是生命活动的基本单位，它由执行不同机体功能的亚细胞组成，而亚细胞功能是由位于其中的蛋白质执行的，蛋白质的正确定位关系到细胞的正常运转和寄主植物的正常生长。病毒侵染过程中的基因组复制、蛋白表达、粒体组装及细胞间转运、病毒蛋白与寄主蛋白的互作等活动都是在特定的亚细胞位点完成。因此，病毒致病蛋白的致病性或引起症状的特征往往与其亚细胞定位有一定的相关性。有些病毒的致病蛋白定位于叶绿体，如RSV NSvc4和CP、CMV的CP等[25,31]，而有些病毒的致病蛋白不需要定位于叶绿体中，它们分散于细胞中，或定位于细胞膜上，或定位于细胞核中，如TMV 6K、RSV SP、ToLCNDV NSP等蛋白[23,31～34]。P8是SRBSDV编码的一种结构蛋白，除此之外，该蛋白的其它功能未知。本研究对P8进行亚细胞定位和致病性研究，结果显示P8主要定位于细胞质，在细胞质内形成小颗粒状聚集体，可引起本氏烟花叶及新叶皱缩。P8蛋白的定位与RSV CP单独表达时相似，都是在细胞质中形成颗粒状结构，单独表达时都能引起寄主花叶症状。但两者参与致病性过程可能不一样，RSV CP和NSvc4共同表达时，CP蛋白被NSvc4拉进叶绿体而起作用。而SRBSDV非结构蛋白(如Pns52、Pns6、Pns71、Pns72、Pns91、Pns92)和P8都是定位于细胞质[23]，因此可能在细胞质进行致病性作用。已报到研究结果显示非结构蛋白中只有Pns92能引起典型的致病症状(花叶)，可能Pns92在SRBSDV的致病性过程中其关键作用[24]。结合本研究P8的亚细胞定位和致病性分析结果，推测P8可能参与病毒的致病过程，配合Pns92等蛋白起致病作用，它们之间的关系还有待于进一步研究。

[1]周国辉，许东林，李华平.广东发生水稻黑条矮缩病病原分子鉴定[A].彭友良.中国植物病理学会2004年学术年会论文集[C].北京：中国农业科学技术出版社，2004：210～212.

[2]周国辉，张曙光，邹寿发，等.水稻新病害——南方水稻黑条矮缩病发生特点及为害趋势分析[J].植物保护，2010，36(2)：144～146.

[3]Zhang H M，Chen J P，Adams M J.Molecular characterisation of segments 1 to 6 of Rice black-streaked dwarf virus from China provides the complete genome[J].Archieve Virology,2001,146:2331～2339.

[4]Wang Q，Yang J,Zhou G H,etal.The Complete Genome Sequence of Two Isolates of Southern rice black-streaked dwarf virus,a New Member of the Genus Fijivirus[J].Journal of Phytopathology,2010,158:733～737.

[5]王康，郑静君，张曙光，等.室内试验证实南方水稻黑条矮缩病毒不经水稻种子传播[J].广东农业科学，2010，(7)：95～96.

[6]曹杨，潘峰，周倩，等.南方水稻黑条矮缩病毒介体昆虫白背飞虱的传毒特性[J].应用昆虫学报，2011，48 (5)：1314～1320.

[7]Matsukura K,Towata T,Sakai J,etal.Dynamics of Southern rice black-streaked dwarf virus in rice and implication for virus Acquisition[J].Phytopathology,2013,103:509～512.

[8]周国辉，温锦君，张曙光，等.呼肠孤病毒科斐济病毒属一新种:南方水稻黑条矮缩病毒[J].科学通报，2008，53 (20)：2500～2508.

[9]朱俊子，周倩，崔亚，等.南方水稻黑条矮缩病毒的新的自然寄主[J].湖南农业大学学报(自然科学版)，2012，38 (1)：58～60.

[10]郭荣，周国辉，张曙光.水稻南方黑条矮缩病发生规律及防控对策初探[J].中国植保导刊，2010，30(8)：17～19.

[11]章松柏，罗汉刚，张求东，等.湖北发生的水稻矮缩病是南方水稻黑条矮缩病毒引起的[J].中国水稻科学，2011，25(2):223～226.

[12]刘万才，刘宇，郭荣.南方水稻黑条矮缩病发生现状及防控对策[J].中国植保导刊，2010，30(3)：17～18.

[13]Hoang A T,Zhang H M,Yang J,etal. Identification,characterization,and distribution of Southern rice black-streaked dwarf virus in Vietnam[J].Plant Disease,2011,95:1063～1069.

[14]Yin X,Xu F,Zheng F,etal. Molecular characterization of segments S7 to S10 of a Southern rice black-streaked dwarf virus isolate from maize in northern China[J].Virologica Sinica,2011,26:47～53.

[15]Cheng Z,Li S,Gao R,etal.Distribution and genetic diversity of Southern rice black-streaked dwarf virus in China[J].Virology journal,2013,10:1～7.

[16]Mao Q,Zheng S,Han Q,etal.New model for the genesis and maturation of viroplasms induced by fijiviruses in insect vector cells[J].Journal of virology,2013,87:6819～6828.

[17]Liu Y,Jia D S,Chen H Y,etal.The P7-1 protein of southern rice black-streaked dwarf virus,a fijivirus,induces the formation of tubular structures in insect cells[J].Archives of Virology,2011,156:1729～1736.

[18]卢嫣红，张金凤，熊如意，等.南方水稻黑条矮缩病毒S6编码一个沉默抑制子[J].中国农业科学，2011，44(14)：2909～2917.

[19]Li J,Xue J,Zhang H M,etal.Interactions between the P6 and P5-1 proteins of southern rice black-streaked dwarf fijivirus in yeast and plant cells[J].Archives of Virology,2013,158:1649～1659.

[20]Jia D S,Chen H Y,Zheng A L,etal.Development of an insect vector cell culture and RNA interference system to investigate the functional role of fijivirus replication protein[J].Journal of Virology,2012,88:5800～5807.

[21]袁正杰，贾东升，吴祖建，等.NSvc4和CP蛋白与水稻条纹病毒的致病相关[J].中国农业科学，2013，46(1)：45～53.

[22]刘利华，吴祖建，林奇英，等.水稻条纹叶枯病细胞病理变化的观察[J].植物病理学报，2000，30(4)：306～311.

[23]章松柏，王开放，刘小娟，等.南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白的亚细胞定位研究[J].热带作物学报，2013，34(11)：1～7.

[24]陈梅香，章松柏，袁正杰，等.南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白的致病性分析[J].杂交水稻，2015，(3)：71～75.

[25]Green M R,Sambrook J.Molecular cloning:a laboratory manual[M].Cold Spring Harbor,N.Y:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012.

[26]Sparkes I A,Runions J,Kearns A,etal.Rapid,transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants[J].Nature Protocols,2006,1:2019～2025.

[27]Bamunusinghe D,Hemenway C L,Nelson R S,etal.Analysis of Potato virus X replicase and TGBp3 subcellular locations[J].Virology,2009,393:272～285.

[28]Liang D L,Qu Z C,Ma X Q,etal. Detection and localization of Rice stripe virus gene productsinvivo[J].Virus Genes,2005,31:211～221.

[29]Wu A Z,Zhao Y,Qu Z C,etal.Subcellular localization of the stripe disease-specific protein encoded by Rice stripe virus(RSV) in its vector,the small brown planthopper,Laodelphaxstriatellus[J].Chinese Science Bulletin,2001,46:1819～1822.

[30]Liu H,Wei C,Zhong Yetal.Rice black-streaked dwarf virus minor core protein P8 is a nuclear dimeric protein and represses transcription in tobacco protoplasts[J].FEBS Letters,2007,581:2534～2540.

[31]朱水芳，叶寅，赵丰，等.黄瓜花叶病毒的外壳蛋白进入叶绿体与症状发生的关系[J].植物病理学报，1992，22(3)：229～233.

[32]Canto T,MacFarlane S A,Palukaitis P.ORF6 of Tobacco mosaic virus is a determinant of viral pathogenicity inNicotianabenthamiana[J].Journal of General Virology,2004,85:3123～3133.

[33]Hussain M,Mansoor S,Iram S,etal.The nuclear shuttle protein of Tomato leaf curl new Delhi virus is a pathogenicity determinant[J].Journal of Virology,2005,79:4434～4439.

[34]Kong L F,Wu J X,Lu L N,etal.Interaction between Rice stripe virus disease-specific protein and host PsbP enhances virus symptoms[J].Molecular plant,2014,7:691～708.

[编辑] 余文斌

2016-11-25

国家自然科学基金项目(31301638)。

陶亚群(1991-)，女，硕士生，研究方向为分子植物病毒学。通信作者：章松柏, yangtze2008@126.com。

S432.1;Q786

A

1673-1409(2017)06-0049-05

[引著格式]陶亚群，彭小琴，李佩，等.南方水稻黑条矮缩病毒P8蛋白的定位和致病性分析[J].长江大学学报(自科版)，2017，14(6)：49～53.