山东海域口虾蛄种群的遗传多样性研究

丁鸽　张代臻　张华彬　唐伯平

摘要：为探讨山东海域口虾蛄種群的遗传多样性，本研究对山东东营、烟台、长山岛、青岛、日照5个样地72个样本，通过线粒体COⅠ基因进行遗传多样性评价，共获得了72条580 bp的DNA序列，定义了30个单元型，31个变异位点，分析得出单元型多样性为0.8700，核苷酸多样性为0.004 024；种群问遗传距离在O.000 9～0.003 8之间。种群内单元型问遗传距离分别为烟台（0.004 1）、青岛（0.004 2）、东营（0.002 7）和日照（0.002 9）。同时揭示烟台、青岛的遗传多样性较高，而东营、日照遗传多样性则相对较低。系统发生树体现了山东海域种群单元型交错分布特性。歧点分布和中性检验值揭示口虾蛄在历史上存在快速扩张的事实。

关键词：口虾蛄；种群；遗传多样性

中图分类号：S931.1 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0254—03

山东海岸线跨越渤海与黄海，具有丰富的海洋生物资源，海产品口虾蛄（Oratosquilla oratoria）别称皮皮虾、虾耙子等，是口足目的优势种，属于节肢动物门（Arthropoda）甲壳纲（Crustaeea）口足目（Stomatopota）虾蛄科（Squillidae）口虾蛄属。口虾蛄生活在水深不足60 m的浅海海域，因其味道鲜美、营养丰富且具有较大的经济价值，是沿海重要的养殖渔业种之一。近年来，随着沿海经济的快速增长，对口虾蛄的大量捕捞而导致其野生资源迅速减少，这势必导致野生口虾蛄群体遗传多样性的降低。加之工业污水、养殖废水的任意排放导致生态环境日益破坏，严重影响了近海生态环境，破坏了口虾蛄等海洋生物的生境，目前亟需对海洋生物资源的遗传状况进行科学评价。

线粒体DNA具有结构简单、母系遗传、变异大、无组织特异性特点，尤其编码线粒体细胞色素C氧化酶基I（cyto-chromec oxidase subunit 1，CO Ⅰ）的基因被作为物种鉴别和遗传水平评价的遗传标记，在海洋动物的分类、遗传多样性分析和资源评价等领域应用广泛，本研究通过线粒体CO，基因对山东海域的东营、烟台、青岛、长山岛及日照等5个样地72只口虾蛄的遗传多样性水平进行评价，为口虾蛄野生资源的遗传状况和资源保护提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验材料

本研究中所用的口虾蛄样本采集于山东海域的东营、烟台、青岛、长山岛及日照5个地方（表1）。样本肌肉组织保存于体积分数95%的乙醇中备用。

1.2万法

1.2.1材料预处理及基因组提取 用灭菌的剪刀取口虾蛄背部肌肉置于1.5 mL离心管内，加入1 mL双蒸水脱乙醇，每隔2 h换水1次，直到乙醇被彻底洗脱，然后用常规的酚一氯仿法提取总基因组DNA。

1.2.2 PCR扩增及测序 PCR反应在ABI 9700 PCR扩增仪上进行，用于CO，基因扩增的特异性引物为KLCOI-1490：5′-GGTCAAATCATAAAGATATTGG-3′和KLCOI-2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。PCR总体积为30μL，反应体系中含有3μL 10×buffer，2μL dNTPs，1μLDNA模板，3μL MgCl₂，上下游引物（10 pmol/L）各1μL及0.2μL Taq酶。加18.8μL ddH₂O补足反应体系。PCR反应：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸60 s，运行30个循环；最后72℃延伸10 min。PCR产物经0.5%琼脂糖凝胶电泳检测。经PCR产物胶回收试剂盒（上海华舜）纯化后，用ABI PRISM BigDye测序反应试剂盒（Perkin-Elmer）在ABI 3730全自动DNA测序仪上完成序列测定。

1.2.3数据的统计分析 序列经Dnastar软件进行拼接后，结合人工校对，再使用Clustal X软件对该序列进行DNA序列对位排列。获得的比对序列用Mega 3.0软件分析序列核苷酸的碱基组成和单元型，计算基于Kimura双参数的单元型及种群遗传距离。用Arlequin 3.01软件计算种群内以及种群问的核苷酸多样性水平、单元型多样性水平等。DnaSP 4.10和Arlequin 3.01软件分析不同种群问的遗传分化指数（F_st）、基因交流大小（N_m）及中性检验；Mega和MrBayes软件构建单元型的遗传进化系统树。

2结果

2.1 CO I基因片段碱基组成及序列变异分析

通过基因组提取、PCR扩增、纯化和测序，本研究分别测得山东的东营、烟台、长山岛、青岛、日照5个区域共72个样本的CO，基因序列片段，经过对位排列和序列剪接后共存在580位点（表2），在这些位点中，统计得到4种核苷酸碱基含量的平均值分别为A=27.6%，T=37.1%，G=17.7%，C=17.6%，其中T的含量最高，C的含量最低，A+T（64.7%）明显高于G+C（35.3%）。在580位点中共定义了31个变异位点，且变异位点中转换与颠换的比值为3.113，可见转换高于颠换。

2.2种群的单元型分析

根据获得的山东海域口虾蛄72条序列，统计分析共定义了30个单元型，分别命名为H1～H30。在30个单元型中，被共享个体数最多的是H4，被来自东营、烟台、青岛、长山岛及日照种群共计24个体共享，占据了个体总数的1/3。此外，被共享单元型还有H1、H2、H3、H5、H15、H20、H26（表2）。

在遗传多样性分析中，5个种群中单元型多样性（表3）最高的是烟台种群（0.964 29），远超平均单元型多样性水平，其次青岛的单元型多样性水平（0.947 37）也远高于平均水平，但是长山岛（0.852 63）、东营（0.800 00）、日照（0.785 71）却远远低于平均单元型多样性水平，且日照的单元型多样性水平最低。核苷酸多样性水平方面，东营和日照较低，分别为0.002 70和0.002 89，而烟台（0.004 06）、青岛（0.004 17）、长山岛（0.004 30）的核苷酸多样性都远超平均值。2.3种群间的遗传距离及系统树

本研究通过双参数模式计算了种群问的遗传距离（表4），根据所获得的结果可以看出，种群问的遗传距离在0.000 9～0.003 8之间，而遗传距离最小的种群则是青岛和长山岛之间（0.000 9），遗传距离最大的是东营和烟台种群之间（0.003 8）。5个种群内部单元型之间的遗传距离从大到小依次为长山岛（0.004 3）、青岛（0.004 2）、烟台（0.004 1）、日照（0.002 9）、东营（0.002 7）（表4）。基于30个单元型构建的系统发生数将所有单元型分为3个大支，而5个种群没有明显以地理分布而聚集成5个簇，而是互相交错分布，未形成显著的种群遗传结构（图1）。

根据Arlequin 3.01软件对山东海域口虾蛄的歧点分布和中性检验进行分析，结果显示，5个种群歧点分布均呈单峰结构，中性检验Fus Fs值和Tajimas D值为，日照Fus Fs：-1.543，Taiima's D：-1.280 11；青岛Fu's Fs：-8.255，TajimaD：-1.970 85；长山岛Fus Fs：-8.022，Taiimas D：-2.020 16；东营Fu's Fs：-0.304，Tajima's D：-0.457 21；烟台Fus Fs：-3.990，Tajima's D：-0.603 86。

3结论

在本研究测得口虾蛄线粒体CO，基因片段中，A+T的百分含量远大于G+C的平均含量，变异位点中含有转换与颠换的比值为3.113，转换明显大于颠换，所有数据与甲壳动物的线粒体组成特征吻合。种群遗传多样性对其环境适应力有很大的影响，遗传多样性的降低直接导致了其对环境适应力的降低，通过对山东海域口虾蛄遗传多样性进行初步研究，分析得出单元型多样性为0.870 0，核苷酸多样性为0.004 024；种群问遗传距离在0.000 9～0.003 8之间。烟台、青岛的遗传多样性较高，而东营、日照遗传多样性则相对较低。种群内单元型问遗传距离分别为烟台（0.004 1）、青岛（0.004 2）、东营（0.002 7）和日照（0.002 9）。构建的系统发生数中5个种群没有明显以地理分布而单独聚集，未形成显著的种群遗传结构，歧点分布和中性检验值揭示口虾蛄在历史上存在快速扩张的事实。