斑马鱼对水源水质的生物预警研究

李清雪，张宝中，车克铠

斑马鱼对水源水质的生物预警研究

李清雪1，张宝中2，车克铠3

（1.河北工程大学 学科规划与建设处，河北 邯郸 056038；2.河北工程大学 能源与环境工程学院，河北 邯郸056038；3.沧州规划设计研究院，河北 沧州 061000）

针对水源水质典型污染物（重金属、有机物），以斑马鱼为试验生物，研究目标污染物对斑马鱼的毒性效应，用SPSS软件计算目标污染物对斑马鱼的半致死浓度，同时进行目标污染物对斑马鱼死亡率的Pearson相关系数检验。结果表明：重金属和有机物对斑马鱼死亡率存在剂量-效应关系；斑马鱼能够灵敏检测水源污染，在污染物浓度极低时（Hg2+为8 μg/L、Cd2+为1.5 mg/L、氯苯为12 mg/L），斑马鱼仍然有响应，因此斑马鱼的毒性测试方法可以用来对水源污染进行生物预警。

水源安全；生物预警；斑马鱼；重金属；有机物

近年来，我国水污染事件频繁发生，严重威胁饮用水水源安全[1]。2005年以来，我国相继发生了松花江硝基苯水污染、太湖蓝藻暴发、山西汾河水库水质污染、湘江镉污染、湖北枝江化学原料污染等水源水质污染事件[2-3]。如何在事故发生的第一时间应用科学合理的预警监测技术实现预警至关重要，其有助于及时识别水质污染和水质异常[4]。目前研究的新型水质综合毒性都是利用生物监测来完成的[5-8]。本文以岳城水库为研究水域，以斑马鱼作为试验生物，研究其对重金属和有机污染物的响应，此实验对及时发现岳城水库当地人民的饮用水安全隐患，及后续污染防治具有重要的科学意义。

1 实验材料和方法

1.1 试验材料

供试斑马鱼购于邯郸市某花鸟鱼虫市场，鱼长（30±5） mm、重（0.3±0.1) g，在实验室（22±1)oC直径为30 cm的鱼缸内驯养12 d。每天喂食并清理粪便和残余饵料，实验前24 h停止喂食，驯养期间未出现鱼体死亡情况。

HgCl2、Pb(NO3)2、Cd(NO3)2、K2Cr2O7、As2O3、苯酚、二甲苯、甲苯、氯苯、苯均为分析纯，购于天津市津东天正精细化学试剂厂。

本试验用水取自岳城水库，水质为Ⅱ水，偶尔会出现Ⅲ水，在用于实验之前进行曝气充氧使得溶解氧≧8.6 mg/L。

母液配制：重金属以离子浓度为10 mg/L配置母液；对于有机物，依次移取所需试剂、一定量助溶剂无水乙醇和乳化剂吐温-80于一小烧杯中混匀，用蒸馏水定容到所需刻度。其中助溶剂和乳化剂不超过0.2%。

1.2 试验方法

首先进行预实验，得到污染物对斑马鱼全致死浓度和全不致死浓度（表1），然后在此浓度范围内按照几何级数梯度设置5个浓度进行正式实验，每个浓度重复3次，同时设空白对照组。实验在直径为30 cm的鱼缸内进行，每个鱼缸放入10尾鱼，每12 h换一次水，以保证试液浓度和溶解氧含量，光暗比12：12（以小时计），温度（22±1)oC，实验周期为96 h，每12 h记录斑马鱼死亡情况及其中毒症状，并及时捞出死鱼。

表1 实验溶液浓度设定Tab.1 Concentration of test solution

1.3 数据处理

数据采用SPSS13.0计算污染物对斑马鱼半致死浓度LC50、Pearson相关系数和95%置信区间。

2 结果分析

2.1 重金属对斑马鱼的毒性效应

斑马鱼的死亡率随不同重金属浓度的发展如图1～图5。

图1 Hg2+对斑马鱼死亡率影响Fig.1 Effect of Hg2+on zebrafish mortality

图2 Pb2+对斑马鱼死亡率影响Fig.2 Effect of Pb2+on zebrafish mortality

图3 Cd2+对斑马鱼死亡率影响Fig.3 Effect of Cd2+on zebrafish mortality

图4 Cr6+对斑马鱼死亡率影响Fig.4 Effect of Cr6+on zebrafish mortality

图5 As3+对斑马鱼死亡率影响Fig.5 Effect of As3+on zebrafish mortality

在重金属对斑马鱼的毒性效应试验中，空白组均未出现鱼的异常反应。当Hg2+、Pb2+、Cd2+、Cr6+、As3+浓度分别超过引起斑马鱼死亡的初始浓度20 μg/L、2 mg/L、2 mg/L、24 mg/L、15 mg/L时，随着重金属离子浓度的增加，斑马鱼死亡率逐渐升高；当其浓度分别达65 μg/L、9.5 mg/L、6.5 mg/L、50 mg/L、80 mg/L时，斑马鱼全部死亡。通过实验观察：斑马鱼对重金属中毒初期，均表现出剧烈、无序游动，身体失衡，同时伴有抽搐现象，中毒症状严重程度与浓度大小基本成正比。对各种重金属浓度和斑马鱼死亡率进行剂量-效应相关性分析，得到Pearson相关系数R。数据结果分析得到96 h半致死浓度LC50，以及95%置信区间（表2）。

实验结果表明：所关注的五种重金属离子，Cr6+、Cd2+、Hg2+、Pb2+、As3+对斑马鱼的LC50见表2，毒性大小依次为Hg2+＞Pb2+＞Cd2+＞As3+＞Cr6+。根据鱼类毒性分级标准[8]，Hg2+为极高毒，Pb2+、Cd2+为高毒，Cr6+、As3+为中毒。各种金属离子浓度与斑马鱼死亡率存在剂量-效应关系。

2.2 有机物对斑马鱼的毒性效应

在有机物对斑马鱼的毒性效应实验中，对照组没有出现异常症状。当苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯、苯浓度分别到达45、85、40、27、160 mg/L时，斑马鱼开始出现死亡现象，随着有机物浓度的增加死亡率升高（图6～图10）。当各有机物浓度分别达到115、178、123、75、340 mg/L时，斑马鱼全部死亡。通过实验观察：斑马鱼受有机污染物影响均表现出兴奋并快速游动，开始竖游、侧游、偶尔出现挣扎性窜动，且伴有麻醉现象。

对各有机物浓度与斑马鱼死亡率进行剂量-效应相关性分析得到Pearson相关系数R。数据结果分析得到96 h半致死浓度LC50以及95%置信区间（表3）。实验结果表明：五种有机污染物中，苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯、苯对斑马鱼的LC50见表3，毒性大小依次为：氯苯＞苯酚＞二甲苯＞甲苯＞苯。根据鱼类毒性分级标准[9]，其中苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯为中毒，苯为低毒，各种有机污染物对斑马鱼死亡率存在剂量-效应关系。

表2 各金属离子对斑马鱼96 h半致死浓度LC50、95%置信区间及相关系数Tab.2 Metal ion 96 h-LC50, 95% conf i dence interval and Pearson correlation coeff i cient

表3 各有机物对斑马鱼96 h半致死浓度LC50、95 %置信区间及相关系数Tab.3 Organic of 96 h-LC50,95% conf i dence interval and Pearson correlation coeff i cient

图6 苯酚对斑马鱼死亡率影响Fig.6 Effect of phenolon zebrafish mortality

图7 甲苯对斑马鱼死亡率影响Fig.7 Effect of toluene on zebrafish mortality

图8 二甲苯对斑马鱼死亡率影响Fig.8 Effect of xylene on zebrafish mortality

图9 氯苯对斑马鱼死亡率影响Fig.9 Effect of chlorobenzene on zebrafish mortality

图10 苯对斑马鱼死亡率影响Fig.10 .Effect of benzene on zebrafish mortality

3 结论

1）通过对比重金属离子对斑马鱼96 h半致死浓度LC50，金属离子毒性大小为：Hg2+＞Pb2+＞Cd2+＞As3+＞Cr6+。根据鱼类毒性分级标准，其中Hg2+为极高毒，Pb2+、Cd2+为高毒，Cr6+、As3+为中毒。各种金属离子对斑马鱼死亡率存在剂量效应关系。

2）根据对比有机污染物对斑马鱼96 h半致死浓度LC50，有机污染物毒性大小为：氯苯＞苯酚＞二甲苯＞甲苯＞苯。根据鱼类毒性分级标准，其中苯酚、甲苯、二甲苯、氯苯为中毒，苯为低毒。各种有机污染物对斑马鱼死亡率存在剂量-效应关系。

3）用重金属离子与有机污染物对斑马鱼的死亡状况加以对比。重金属离子对斑马鱼致死程度比较高，有机污染物对斑马鱼的有较强的麻醉作用。

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[4]袁永钦，匡 科，沈 军.广州市西江引水工程水质预警系统研究与实践[J].中国给水排水，2011(6)：1-5.

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[9]国家环保局.水和废水监测分析方法[M].4版.北京：中国环境科学出版社，2002：780-781.

（责任编辑 王利君）

Biological early warning for water quality on zebrafish

LI Qingxue1,ZHANG Baozhong2,CHE Kekai3

(1.Department of Disciplines Plan and Construction, Hebei University of Engineering, Hebei Handan, 056038, China；2.College of Urban Construction, Hebei University of Engineering, Hebei Handan, 056038, China；3.Institute of Plan and Design, Traffic South Street, Xinhua District, Hebei Cangzhou, 061000, China)

The early warning of water source pollution with biological monitoring method is studied. The zebrafish is used as the experimental object. And the SPSS according to behavioral difference of fish in different toxicity environment. The study shows that the dose effect relationship was exists between heavy metals, organic compounds and zebrafish mortality. As a result, toxicity testing methods on zebrafish can be used to carry on biological pre-alarm for water pollution.

Water security; biological monitoring; zebrafish; heavy metal; organic compound

X832

A

1673-9469（2017）01-0061-05

10.3969/j.issn.1673-9469.2017.01.014

投稿日期：2016-09-12 特约专稿

水利部公益性行业科研专项（201401030）

李清雪（1964-），女，河北大名人，博士，教授，从事水处理方面研究。