重金属Cu2+、Cd2+对光裸方格星虫的急性毒性效应

陈振国，班庭辉，周鸿凯

(1.湛江市碧海湾水产科技有限公司，广东 湛江 5243002；2.广东海洋大学农学院，广东 湛江 524088)

重金属Cu2+、Cd2+对光裸方格星虫的急性毒性效应

(1.湛江市碧海湾水产科技有限公司，广东 湛江 5243002；2.广东海洋大学农学院，广东 湛江 524088)

为探讨重金属离子Cu2+、Cd2+对光裸方格星虫的急性毒性效应，设置了6个浓度梯度和3个处理时间，观察记录方格星虫死亡情况及组织形态图检。结果表明：1)在具有一定Cu2+和Cd2+浓度处理中的光裸方格星虫均呈现中毒现象，光裸方格星虫的死亡率随着重金属离子浓度的增加和处理时间的延长而逐渐升高，具有明显的剂量与时间效应。2)Cu2+对光裸方格星虫的毒性大于Cd2+，Cu2+对光裸星虫的48 h LC50和72 h LC50值分别为10.60 mg/L和4.36 mg/L，Cd2+的48 h LC50和72 h LC50分别为11.95 mg/L和5.76 mg/L。3)光裸方格星虫的食道及胃肠道是重金属离子的主要侵害部位，也是较先受到毒性作用的部位。

光裸方格星虫；Cu2+；Cd2+；急性中毒；半致死浓度LC50

光裸方格星虫(Sipunculusnudus)，俗称沙虫，属方格星虫纲(Sipunculidea Haschek)、方格星虫目(Sipunculif- ormes Cutleret Gibbs)、方格星虫科(Sipunculidae Quatrefages)、方格星虫属(SipunculusLinnaeus)[1]，是一种非常美味的海鲜品种。其生长在沿海滩涂，主要分布在泥沙质底层，属于取食沉积物类型，吞噬底质中的有机质，主要以底质中的有机碎屑和细菌为食。光裸方格星虫对生长环境十分敏感，水体受污染会导致其死亡，所以有“环境标志生物”之称。

重金属离子Hg、Cd、Pb、Cr以及类金属As等具有显著的生物毒性[2]，往往能在低浓度下产生很高的毒性。随着工业化进程的加快，来自农药、医药、仪表及各类有色金属矿山等工业产生的废水是对水体污染最严重的因素之一[3]，并且未经处理就排放最终进入海洋[4]。重金属污染的特点主要有：1)污染范围广、持续时间长；2)毒性强、危害大；3)生物放大作用；4)具有一定隐蔽性[5]。重金属污染对动物机体的危害主要是引起肝脏[6]、血液循环系统和神经系统的损伤；其对动物体产生影响的主要方式是抑制动物酶活性和影响动物蛋白质，以及影响动物生物大分子[7]。水体环境中的重金属污染不但影响水生生物的产量和质量，而且由于重金属性质稳定、不易分解、脂溶性强以及与蛋白质或酶有较高的亲和力等特点，导致在环境中进行迁移时，一旦进入食物链[8]，就可能因生物浓缩和生物放大作用而在生物体内蓄积[9]。当重金属在生物体内达到一定浓度时，就会对该生物体本身产生损伤，也会通过水生食物链的富集作用对人类造成危害，从而严重威胁着人类的身体健康和生命安全。

Cd是生物体非必需的金属元素[10]，而且它对生物体毒害较大。在水生生态中Cu为生物体必需的微量金属元素，生物体的许多生理生化反应都需要它的参与，但是Cu含量超标也会引起生物体中毒。重金属对生物的毒性，不与水域中金属总浓度相关，而是主要取决于游离(水合)的金属离子，如Cd主要取决于游离Cd2+浓度，Cu取决于游离Cu2+及其氢氧化物。鉴于重金属污染是当前环境污染和环境治理最为关键的问题，本研究应用水生生物毒性试验方法[11]，通过配制不同浓度的重金属液构筑方格星虫急性毒性实验模型，借助数理统计的方法和组织病理切片观察，研究重金属离子Cu2+、Cd2+对方格星虫的急性毒性作用和重金属对方格星虫机体组织的损伤作用，为光裸方格星虫的后续研究提供资料。

1 材料方法

1.1 试验动物

裸体方格星虫采集于北部湾的湛江近海域——“沙虫第一乡”遂溪县草潭镇沙虫养殖场，重量为(10±0.5)g/条，体长约5～8 cm。

1.2 主要试剂和仪器

甲醛、二甲苯、CuSO4·5H2O、CdCl2均为国产分析纯试剂。组织包埋机、切片机、烤片机等均为湖北省孝感市宏业医用仪器有限公司生产。

1.3 实验方法

1.3.1 试验设计

2015年5月10日将体重为(10±2)g的光裸方格星虫带回实验室后，先放置于未添加重金属的海水中(水温26℃、盐度2.13%、pH7.8、溶解氧7.54 mg/L)暂养4 d。待其消化道内完全排净沙后，挑选虫体胞满、体表完整、个体活动能力正常、活力良好的个体供实验用。每个5 000 mL的烧杯加5 cm厚度的从养殖场带回的海沙，然后放入10只方格星虫，并添加1 L含有设定浓度重金属的海水(水温26℃、盐度2.13%、pH7.8、溶解氧7.54 mg/L)，每12 h换水1 次，实验时不投饵料，3个重复。通过预实验的结果分析，本试验以CuSO4·5H2O和CdCl2配制的浓度梯度为0.0、5.6、10.0、18.0、32.0、56.0 mg/L等6个梯度等级，其相应的海水中重金属Cu2+和Cd2+的浓度梯度分别是0.00、1.44、2.56、4.61、8.19、14.34 mg/L和0.00、3.43、6.13、11.04、19.62、34.34 mg/L。观察两种重金属对光裸方格星虫的单一急性毒性作用。

1.3.2 死亡判定

在强刺激下吻不收缩、身体松软无活力，用玻璃棒轻触或镊子夹取其吻部或身体，许久不做出反应者可判定为死亡个体[12]。

1.3.3 组织形态学观察

将光裸星虫置于不同浓度的Cu2+和Cd2+重金属溶液中，观察其机体活动以及形态变化，并给予一定强度的刺激，观察其机体活力及形态变化。在进行重金属染毒处理后第24 h、48 h、72 h均需对各组虫体进行濒死判定。对于濒死个体，及时解剖并观察其症状，做好相应记录后立即放置在10%甲醛液中进行活体组织固定。然后，制作组织切片，观察。

1.4 统计分析

应用统计软件SPSS 18.0对试验数据进行统计分析处理，求得不同类型重金属分别在48 h和72 h内对光裸方格星虫的半致死浓度(LC50)、95%置信区间及回归方程。

2 结果分析

2.1 中毒症状观察

在Cu2+和Cd2+的染毒实验组中，光裸方格星虫均出现了中毒现象，同时其机体活力发生明显的变化。刚放入含重金属海水中时，光裸方格星虫运动剧烈，随后出现吻和身体的放松，其吻的伸缩能力明显降低，并且逐渐变细、透明度增加，触手如果伸长则成菊花状，此时虫体活力很弱，对外界刺激不敏感。随着实验时间的延长，虫体表现为肌肉极柔软，直至吻和身体完全舒张，呈松弛状态，对外界刺激不再做出任何反应，即死亡。死亡后可见虫体吸水膨胀，也有个别虫体重金属中毒后会吐出体腔液，光裸方格星虫死亡时在多数虫体吻端可见紫色团状物，虫体肛门处外翻且颜色较深。通过组织切片观察可见，中毒死亡虫体的纤毛脱食道结构毁坏，肌肉组织损伤等现象。

2.2 急性毒性作用试验结果

从表1、表2可以看出，光裸方格星虫的平均死亡率随着这两种重金属浓度梯度的增高和处理时间的延长而增加，即重金属对光裸方格星虫的毒性作用具有明显的剂量和时间效应。虫体发生中毒反应的速度随重金属离子浓度的不同而变化，在接触含重金属Cd2+试液约12 h后，56.0 mg/L组首先出现中毒现象，短时间内就出现死亡；而在低浓度或短时间内，有些虫体中毒反应相对较缓慢，要经过较长时间才会出现死亡，有的个体呈“假死”状态，长时间无活动，但在强烈的刺激下，仍可见缓慢收缩现象。

表1 CuSO4·5H2O对光裸方格星虫的急性毒性作用结果

注：各项目的测试数据为平均值±标准差(n=3)。下表同此。

Notes：The test data for each item was the mean±standard deviation(n=3).The same in the following tables.

表2 CdCl2对光裸方格星虫的急性毒性作用结果

表3 Cd2+、Cu2+对光裸方格星虫的急性毒性作用的回归分析

表3的回归分析表明，CuSO4·5H2O在48 h和72 h的LC50分别为41.4 mg /L和16.7 mg/L，即 Cu2+在48 h和72 h的LC50分别为10.60 mg /L和4.36mg/L；CdCl2在48 h、72 h对光裸方格星虫的LC50分别为19.5 mg/L和9.4 mg/L，即Cd2+在48 h、72 h对光裸方格星虫的LC50分别为11.95 mg/L和5.76 mg/L，表现为在48 h和72 h内，Cu2+对光裸方格星虫的毒性均强于Cd2+。

2.3 重金属中毒后光裸方格星虫的组织形态学变化

由图1-A可见，光裸方格星虫纤毛(CI)、食道皱襞(EF)等结构均完整，细胞大小正常，而图1-B可见纤毛等结构已经脱落、皱襞中上皮黏膜层(EMF)大部分已经严重脱落；图1-C可见只剩肌层及外膜(LM)，其余部分均已脱落；图1-D为正常方格星虫肌肉组织横切可见角质层(C)、上皮(E)、结缔组织层(MF)、环肌层(RML)、纵肌层(LML)等结构均完整；图E可见只剩肌层及外膜，其余部分均已脱落；图F可见其角质层(C)及上皮(E)部分破损，环肌层肌(RML)也可见部分肌纤维损伤。

图1 光裸方格星虫组织切片观察结果

注：CI：纤毛；EF：食道皱襞；EMF：皱襞中上皮黏膜层；AD：外膜；LM：肌肉层；C：角质层；E：上皮；MF：结缔组织层；LML：纵肌层肌；RML：环肌层肌。

Notes：CI indicated cilium；EF indicated esophageal folds；EMF indicated epithelial mucosa folds；AD indicated adventitia；LM indicated lamina muscularis；C indicated corneum；E indicatad epithelium；MF indicated muscle fibre；LML indicated longitudinal muscular layer；RML indicated connective tissue layer.

3 讨论

正常的光裸方格星虫食道横切面由内到外清晰可见有黏膜[13]、黏膜下层和外膜等结构，其中黏膜层为单层柱状纤毛上皮细胞，细胞核近基部，呈圆形，食道黏膜纵行褶皱呈长指状，黏膜下层为疏松结缔组织。光裸方格星虫虫体壁呈半透明状，由外到内依次可分为角质层、上皮、结缔组织层、环肌层、纵肌层和壁体腔膜等6个部分[14]，这与本试验中的对照组结构类似。

重金属的毒性主要取决于游离(水合)的金属离子浓度[15]，如Cd主要取决于游离Cd2+浓度，Cu取决于游离Cu2+及其氢氧化物的量。而重金属的化学形态则取决于它的来源及其进入水体后与水中其他物质能够发生的相互作用，因而水体中的重金属形态会随环境条件的不同而变化。重金属对生物组织的急性毒性作用机理为[16]对动物酶的活性的影响包括诱导和抑制、对生物大分子、动物蛋白质和核酸的影响如破坏他们的结构等。近年来也研究发现[17]，重金属除可导致蛋白质化学损伤作用外，亦可诱导生物机体内一些功能蛋白生成，如应激蛋白和金属硫蛋白。但当重金属在生物体内累积量超过体内金属硫蛋白的合成速度时，多余的重金属离子就会与体内的其他生物分子，包括酶和核酸等生物大分子相互作用，从而引起中毒现象。光裸方格星虫循环系统的功能由体腔液担任，而且其体液是个开放的组织系统，对于任何酶活性的变化都会给整个系统带来影响，因此其机体对外界环境变化的敏感性强。本研究表明，一定剂量的重金属Cd2+和Cu2+即可导致光裸方格星虫表现出明显的中毒反应甚至死亡，同时也导致星虫体壁的渗透平衡被破坏，其身体吸水膨胀。这是由于一定剂量的重金属离子可抑制水生生物酶的活性[10，16]，当剂量加大而超过生物自身的解毒能力时，则表现出明显的中毒反应甚至死亡。

本研究结果表明，Cu2+和Cd2+均对光裸方格星虫有很强的毒性作用，其致死和半致死起始浓度有所差异，方格星虫对这两种重金属离子吸收和耐受能力不同。这种差异表明了Cd作为生物非必需元素，对光裸方格星虫表现出较强的毒性，这可能与星虫体内Cd硫蛋白的结合能力有关。然而，Cu2+在最初反应不太明显，在48 h内中低浓度组中毒死亡现象相对较少，但在72 h后，死亡数突然增加，光裸方格星虫对低浓度重金属离子Cu2+短期内的调节作用可能与其体内的解毒贮存功能有关，当其体内重金属离子积累一定浓度后，将会使得其体内蛋白与重金属离子结合而减轻其毒性；但是随着暴露时间的增加，体内累积重金属离子浓度增加，这时蛋白质与离子结合达到饱和，解毒作用减弱，导致死亡率增加。本研究中，在Cu2+的24 h组的实验中，死亡率并未随着处理浓度的升高而增加，但在CuSO4·5H2O处理梯度为18 mg/L 时而突然增加，其原因可能是由于当时并未意识到“假死”现象，后来通过查阅相关资料已经避免类似情况发生。

随着Cu2+和Cd2+浓度增加，星虫死亡率呈上升趋势。当Cu2+浓度为1.43 mg/L时，光裸方格星虫24 h内的死亡率为0；当Cu2+浓度>4.61 mg /L时，48 h和72 h内星虫的死亡率均明显增加。当Cd2+浓度>6.13 mg /L 时，光裸方格星虫48 h和72 h内的死亡率明显增加。Cu2+在48 h对光裸方格星虫的LC50为10.60 mg /L，Cd2+在48 h的LC50为11.95 mg/L。

此次实验中的重金属离子主要是随着方格星虫采食而进入其机体内，所以食道及胃肠道是重金属离子的主要侵害部位，也是较先受到毒性作用的部位，Michel等[18]在研究光裸方格星虫的消化道结构时认为，其消化酶的分泌主要在下行肠中进行，而营养的吸收则全部发生在上行肠的中上段，所以重金属离子对虫体消化道的损伤作用在消化道的中上段更为明显。也有研究认为[19]，细胞损伤的机理主要是有毒物质与膜蛋白相互作用于ATP酶控制的Na+-K+离子的分布，从而造成膜通透性改变，而毒物对酶的抑制为不可逆性的抑制，因此造成生物体的细胞损伤。

[1]陈细香，林秀雁，卢昌义，等.方格星虫属动物的研究进展[J].海洋科学，2008，32(6)：66-70.

[2]刘静宜，任安璞，彭安，等.环境化学[M].北京：中国环境科学出版社，1987.

[3]Rainbow P S.Copper，cadmium and zinc concentrations in oceanic amphipod and euphausiid crustaceans，as a source of heavy metals to pelagic seabirds[J].Mar.Biol，1989，103(4)：513-518.

[4]国家海洋局.2006年中国海洋环境公报[J].海洋世界，2007，(2)：4-5.

[5]肖安东，匡光伟.重金属对畜产品安全的危害与对策[J].中国兽药杂志，2011，45(4)：49-51.

[6]朱映川，刘雯，周遗品，等.水体重金属污染现状及其治理方法研究进展[J].广东农业科学，2008，(8)：143-146.

[7]孔繁翔.环境生物学[M].北京：高等教育出版社，2000.

[8]Eisler R.Trace metal concentrations in marine organisms[M].New York：Pergamon Press，1981.

[9]Rainbow P S.海洋生物对重金属的积累及意义[J].海洋环境科学，1992，11(1)：44-52.

[10]贺亮，范必威.海洋环境中的重金属及其对海洋生物的影响[J].广州化学，2006，(3)：63-69.

[11]周永欣，章宗涉.水生生物毒性试验方法[M].北京：中国农业出版社，1989.

[12]李俊辉，王忠维.重金属离子对裸体方格星虫的急性毒性试验[J].安徽农业科学，2011，39(3)：1482-1483.

[13]吴鹏飞，王嫣，顾志峰，等.光裸方格星虫消化道的形态和组织学观察[J].渔业科学进展，2010，31(1)：74-79.

[14]邓中日，黄勃，方再光.裸体方格星虫体壁形态和组织学结构[J].湖南城市学院学报(自然科学版)，2007，16(1)：62-65.

[15]曾灿星，陈静生.研究不同金属形态的毒性效应在探讨重金属水环境容量中的作用[J].环境化学，1986，5(5)：1-11.

[16]赵红霞，詹勇，许梓荣.重金属对水生动物毒性的研究进展[J].中国兽医杂志，2004，28(4)：13-18.

[17]Roesijadi G.Metallothioneins in metal regulation and toxicity in aquatic animals[J].Toxicol.，1992，22(2)：81-114.

[18]Brown C L，Michel C，Devillez E J.Structural and biochemical observations on the ipunculid digestive tract[J].American zoologist，1979， 19(3)：908.

[19]郭永灿，王振中，张友梅，等.重金属对蚯蚓胃肠道上皮细胞超微结构损伤的研究[J].生态学报，1997，17(3)：282-287.

Acute toxicity effect of heavy metal Cu2+and Cd2+onSipunculusnudusCHEN

Zhenguo1，BANTinghui1，ZHOUHongkai2*

(1.Bihaiwan Aquatic Science and Technology Co.Ltd.in Zhanjiang，Zhanjiang 524300，China；2.College of Agronomy，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

In order to explore the acute toxicity effect of heavy metal ions(Cu2+and Cd2+)onSipunculusnudus，we set six concentration gradients and three processing time to observe mortality and histological test ofSipunculusnudus.The results showed that：1)Sipunculusnuduswere poisoned in certain concentrations of Cu2+and Cd2+.The mortality rate ofSipunculusnudusincreased with the increasing of heavy metal ions concentration and the extension of processing time，which had the obvious dosage and time effect.(2)The Cu2+function of toxicity was greater than that of Cd2+inSipunculusnudus.The LC50values of Cu2+at 48 h and 72 h were 10.60 mg/L and 4.36 mg/L，respectively，and the LC50values of Cd2+at 48 h and 72 h were 11.95 mg/L and 5.76 mg/L,respectively.3)The esophagus and gastrointestinal were the mainly and first part poisoned inSipunculusnudusof heavy metals.

Sipunculusnudus；Cu2+；Cd2+；acute toxicity；median lethal concentration( LC50)

2016-12-02 资助项目：国家自然科学基金(41073059)；湛江市科技招标项目(编号：2011C0102).

陈振国(1986-)，男，本科，研究方向：海水养殖.E-mail:597255767@qq.com

周鸿凯(1962-)，男，教授，研究方向：生态环境安全相关研究. E-mail: 897961801@qq.com

S968.9

A

1006-5601(2017)02-00090-07

陈振国，班庭辉，周鸿凯.重金属Cu2+、Cd2+对光裸方格星虫的急性毒性效应[J].渔业研究，2017，39(2)：90-96.