神香草不同洗脱物对豚鼠离体气管平滑肌收缩的影响Δ

袁凤娟，孙玉华，哈木拉提·哈斯木，王新堂，贺金华#，毛 艳（1.新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐830054；.新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐 830004）

·民族医药·

神香草不同洗脱物对豚鼠离体气管平滑肌收缩的影响Δ

袁凤娟1，2＊，孙玉华2，哈木拉提·哈斯木2，王新堂2，贺金华2#，毛 艳2（1.新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐830054；2.新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐 830004）

目的：考察维药神香草不同洗脱物对豚鼠离体支气管平滑肌收缩的影响。方法：制备豚鼠离体气管环后浸泡于克-亨液中，以乙酰胆碱（ACh，1×10－7g/m L）或组胺（His，1×10－6g/m L）致气管环收缩，然后分别考察质量浓度为0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56mg/m L的神香草水洗脱物和30%、50%、60%、70%、95%的乙醇洗脱物对气管环收缩的影响，记录收缩曲线并计算解痉率；试验均以生理盐水为空白对照，以氨茶碱（0.08mg/m L）为阳性对照。结果：与空白对照比较，0.16～2.56mg/m L的30%、50%乙醇洗脱物，0.32～2.56mg/m L的60%乙醇洗脱物以及0.64～2.56mg/m L的70%、95%乙醇洗脱物均可明显抑制ACh致气管环收缩，解痉率均明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；0.32～2.56mg/m L的水洗脱物和30%、50%乙醇洗脱物，0.16～2.56mg/m L的60%、70%乙醇洗脱物以及1.28～2.56mg/m L的95%乙醇洗脱物可明显抑制His致气管环收缩，解痉率均明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；其中2.56mg/m L的60%乙醇洗脱物作用效果与氨茶碱接近。结论：神香草不同洗脱物对ACh或His致豚鼠离体支气管平滑肌收缩均有一定的抑制作用；其中以60%乙醇洗脱物作用最强，其在高质量浓度下作用与氨茶碱相当。

神香草；洗脱物；离体气管；乙酰胆碱；组胺；豚鼠

支气管哮喘（Bronchialasthma，简称“哮喘”）具有可逆性支气管收缩、气流阻塞等特征，当哮喘发作时，患者发生气道反应性狭窄甚至闭塞，严重呼吸困难，致使气道功能降低[1-2]。研究表明，哮喘患者胆碱能神经功能亢进，发作时组胺H1受体数量增多[3]。目前多采用激素（糖皮质激素）、β2受体激动药、茶碱、抗胆碱药等缓解哮喘症状，但长期服用这类药物可产生许多副作用，如肥胖、自发性骨折、心率失常等[4]。因此，开发低毒、副作用较小的药物并阐明其作用机制具有重要的理论意义和临床应用价值。

神香草为唇形科植物硬尖神香草（Hyssopus cuspidatus Boriss.）的干燥地上部分[5]，维吾尔名为“祖帕奇尼”，其性质干热，全草入药，主要含有挥发油、黄酮、生物碱等化学成分，具有解除支气管痉挛、镇咳、祛痰的药理作用。维吾尔族用神香草治疗气管炎已有百年的历史，且疗效显著[6-7]，以神香草为主药的寒喘祖帕颗粒已被收载于《维吾尔药分册》中[8]。近年来，国内外学者对神香草的报道主要集中在抗衰老、降糖、镇咳、祛痰、抑菌等方面[9]，对其舒张支气管方面报道较少。为进一步考察神香草对支气管的舒张作用，笔者考察不同洗脱物对乙酰胆碱（ACh）和组胺（His）引发的支气管收缩的影响。

1 材料

1.1 仪器

BL-420F生物机能实验系统、HV-4离体组织器官恒温灌流系统和HW-1000超级恒温水浴系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 药材与试剂

神香草采自阿勒泰地区，经新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定为唇形科植物硬尖神香草的干燥地上部分；ACh、His（美国Sigma公司，批号：BCBM 4814V、WXBB2337V，纯度：≥99.0%）；氨茶碱注射液（以下简称氨茶碱，常州兰陵制药有限公司，批号：11409051，规格：25mg/m L）。

1.3 动物

豚鼠12只，♀（无孕）♂各半，体质量为350～400 g，由新疆维吾尔自治区实验动物研究中心提供，动物合格证号：65000200000477。豚鼠饲养于新疆维吾尔自治区药物研究所SPF级动物房内，室温为（24±1）℃、通风良好，饲养期间自由饮食。

2 方法

2.1 神香草不同洗脱物的制备

取神香草干燥地上部分30 kg，粉碎成寸段，用12倍量水加热回流提取2次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩至适当浓度，上样于聚酰胺树脂。分别用水和30%、50%、60%、70%、95%乙醇进行洗脱，收集相应洗脱液，浓缩后置于真空干燥箱中干燥，得各洗脱物干燥浸膏。其收率分别为：水洗脱物，23.05%；30%乙醇洗脱物，14.57%；50%乙醇洗脱物，14.12%；60%乙醇洗脱物，10.04%；70%乙醇洗脱物，8.01%；95%乙醇洗脱物，5.24%。

2.2 豚鼠离体气管环的制备

将豚鼠ip戊巴比妥钠（45mg/kg）麻醉，腹面正中切开颈部皮肤和皮下组织，细心分离出气管，自甲状腺软骨至气管分叉处剪下全部气管，放入盛有预先用混合气体（95%O2和5%CO2）饱和的克-亨液（Krebs-Henseleit）的培养皿中，去除气管周围的结缔组织，然后在气管的腹面（软骨环面）将气管剪成3～5mm的气管环，将气管环置于盛有10m L克-亨液的恒温套瓶中，并持续通入95%O2和5%CO2的混合气体，维持套瓶温度为（37± 0.5）℃、pH为7.4。每根气管环用2个三角形挂钩贯穿其管腔，一端固定，另一端接于张力传感器，张力变化由BL-420F生物机能实验系统采集并记录。调节初始张力为1.5 g左右，稳定60m in，气管环初始张力稳定过程中每30min更换一次预温至37℃的克-亨液[10]。

2.3 ACh、His致豚鼠气管平滑肌收缩的浓度筛选

向制备好的气管环中加入质量浓度分别为1×10－11、1×10－10、1×10－9、1×10－8、1×10－7g/m L的ACh溶液或质量浓度分别为1×10－11、1×10－10、1×10－9、1×10－8、1×10－7、1× 10－6g/m L的His溶液，与气管环接触5min，待张力曲线上升至最明显处，气管收缩达到稳定值时，观察曲线上升幅度。记录气管环收缩曲线，并计算气管收缩率[收缩率（%）＝（收缩前曲线高度－收缩后曲线高度）/收缩前曲线高度×100%]，实验共重复8次。

2.4 神香草不同洗脱物对ACh致豚鼠气管平滑肌收缩的舒张作用考察

按“2.1”项下方法制备豚鼠离体气管环，等基线平稳后向10m L浴槽中加入ACh（1×10－7g/m L），待张力曲线上升至最明显处（即气管收缩达到高峰时）稳定15m in，然后分别加入质量浓度为0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56mg/m L（以浸膏计）的神香草不同洗脱物，并另设加入生理盐水的空白对照以及加入氨茶碱（0.08mg/m L）的阳性对照。每加一种药物，接触5min，观察曲线下降幅度、气管松弛情况，记录气管环收缩曲线，并计算解痉率[解痉率（%）＝（给药前曲线高度－给药后曲线高度）/给药前曲线高度×100%]，实验共重复8次。

2.5 神香草不同洗脱物对His致豚鼠气管平滑肌收缩的舒张作用考察

按“2.1”项下方法制备豚鼠离体气管环，等基线平稳后，向10m L浴槽中加入His（1×10－6g/m L），待张力曲线上升至最明显处（即气管收缩达到高峰时）稳定15m in，然后分别加入质量浓度为0.08、0.16、0.32、0.64、1.28、2.56mg/m L（以浸膏计）的神香草不同洗脱物，并另设加入生理盐水的空白对照和加入氨茶碱（0.08mg/m L）的阳性对照。每加一种药物，接触5min，观察曲线下降幅度、气管松弛情况，记录气管环收缩曲线，并计算解痉率（计算公式同“2.4”项下），实验共重复8次。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 ACh、His致豚鼠离体气管环收缩的浓度筛选结果

ACh和His能够较好地引起豚鼠离体气管环的收缩，ACh在用量为1×10－7g/m L时能够较明显地收缩气管，同质量浓度下His的敏感度弱于ACh，但His在质量浓度为1×10－6g/m L时对支气管的收缩作用与1×10－7g/m LACh相当，结果见表1。

表1 不同质量浓度ACh和His作用后气管收缩率测定结果（±s，n＝8，%%）Tab 1 Determ ination results of tracheal contraction rate after treated w ith ACh and H is of different concentrations（±s，n＝8，%%）

表1 不同质量浓度ACh和His作用后气管收缩率测定结果（±s，n＝8，%%）Tab 1 Determ ination results of tracheal contraction rate after treated w ith ACh and H is of different concentrations（±s，n＝8，%%）

样品ACh His质量浓度，g/mL 1×10－1120.22±11.7 9.00±6.90 1×10－1033.13±17.16 18.91±10.33 1×10－941.06±15.11 29.61±12.51 1×10－850.97±13.43 41.60±13.02 1×10－760.25±14.25 53.97±9.59 1×10－663.04±11.44

3.2 神香草不同洗脱物对ACh致豚鼠气管平滑肌收缩的舒张作用考察结果

神香草不同洗脱物均能不同程度地抑制1×10－7g/m LACh引起的豚鼠离体气管环收缩，且呈浓度依赖性。与空白对照比较，0.16～2.56mg/m L的30%、50%乙醇洗脱物，0.32～2.56mg/m L的60%乙醇洗脱物以及0.64～2.56mg/m L的70%、95%乙醇洗脱物均可明显抑制ACh致气管环收缩，解痉率均明显升高（P＜0.05或P＜0.01），且2.56mg/m L的60%乙醇洗脱物的作用效果最为显著，与氨茶碱接近，详见表2。

表2 神香草不同洗脱物对ACh致气管收缩的解痉率测定结果（±s，n＝8，%%）Tab 2 Determ ination results of antispasmodic rate of H.cuspidatus different elutions on ACh-induced tracheal contraction（±s，n＝8，%%）

表2 神香草不同洗脱物对ACh致气管收缩的解痉率测定结果（±s，n＝8，%%）Tab 2 Determ ination results of antispasmodic rate of H.cuspidatus different elutions on ACh-induced tracheal contraction（±s，n＝8，%%）

注：空白对照解痉率为（3.84±1.62）%，阳性对照解痉率为（54.15±7.98）%；与空白对照比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：the antispasmodic rate of blank control is（3.84±1.62）%，the antispasmodic rate of positive control is（54.15±7.98）%；vs.blank control，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

样品水洗脱物30%乙醇洗脱物50%乙醇洗脱物60%乙醇洗脱物70%乙醇洗脱物95%乙醇洗脱物质量浓度，mg/mL 0.08 2.98±0.98 4.78±3.2 4.57±3.07 1.08±0.25＊3.07±3.05 2.87±2.03 0.16 3.35±3.13 9.70±0.15＊＊10.08±2.89＊8.74±2.89 5.14±3.51 6.78±4.57 0.32 7.14±2.73 14.06±3.46＊＊18.12±6.13＊＊15.46±4.55＊10.25±4.96 11.89±5.84 0.64 8.57±2.67＊19.12±7.93＊23.36±8.238＊23.46±12.13＊16.99±8.27＊14.14±4.17＊1.28 9.51±4.06＊30.51±5.08＊＊31.27±6.29＊＊34.74±18.02＊26.76±9.66＊＊19.64±2.64＊＊2.56 10.88±5.21＊38.93±2.85＊＊37.48±7.70＊＊52.43±7.97＊＊33.10±10.77＊＊26.31±3.36＊＊

3.3 神香草不同洗脱物对His致豚鼠气管平滑肌收缩的舒张作用考察结果

神香草不同洗脱物均能不同程度地抑制1×10－6g/m LHis引起的豚鼠离体气管环收缩，且具有浓度依赖性。0.32～2.56mg/m L的水洗脱物和30%、50%乙醇洗脱物，0.16～2.56mg/m L的60%、70%乙醇洗脱物以及1.28～2.56mg/m L的95%乙醇洗脱物可明显抑制His致气管环收缩，解痉率均明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；其中以2.56mg/m L的60%洗脱物作用效果最为显著，与氨茶碱接近，详见表3。

表3 神香草不同洗脱物对His致气管收缩的解痉率测定结果（±s，n＝8，%%）Tab 3 Determ ination results of antispasmodic rate of H.cuspidatus different elutions on His-induced tracheal contraction（±s，n＝8，%%）

表3 神香草不同洗脱物对His致气管收缩的解痉率测定结果（±s，n＝8，%%）Tab 3 Determ ination results of antispasmodic rate of H.cuspidatus different elutions on His-induced tracheal contraction（±s，n＝8，%%）

注：空白对照解痉率为（3.84±1.62）%，阳性对照解痉率为（54.15±7.98）%；与空白对照比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：the antispasmodic rate of blank control is（3.84±1.62）%，the antispasmodic rate of positive control is（54.15±7.98）%；vs.blank control，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

样品水洗脱物30%乙醇洗脱物50%乙醇洗脱物60%乙醇洗脱物70%乙醇洗脱物95%乙醇洗脱物质量浓度，mg/mL 0.08 9.83±5.04 8.43±6.87 13.69±8.17 22.57±8.32 13.02±6.16 17.70±12.01 0.16 21.26±8.22 20.22±13.40 22.67±8.12 35.74±10.55＊＊21.03±4.93＊22.91±13.69 0.32 24.17±4.72＊26.54±11.20＊31.26±6.43＊＊41.27±10.58＊＊26.34±7.24＊25.70±16.32 0.64 25.68±6.52＊32.95±9.77＊＊38.10±10.57＊＊47.05±9.03＊＊32.46±10.39＊26.33±23.10 1.28 30.88±6.88＊＊36.82±9.74＊＊41.88±10.22＊＊58.19±11.60＊＊35.71±17.62＊33.37±9.92＊＊2.56 35.00±7.42＊＊40.54±10.70＊＊49.27±10.01＊＊65.83±12.03＊＊40.91±21.34＊39.34±9.16＊＊

4 讨论

豚鼠离体气管实验是评价抗哮喘药物的常用方法，本研究采用豚鼠离体气管环，可以直接观察受试药物对气管平滑肌收缩的抑制作用；然后用生物机能实验系统记录支气管平滑肌收缩与舒张时的张力曲线，方法简单可行，结果准确、重现性好。氨茶碱是一种治疗哮喘“物美价廉”的药品，其血药浓度在10～20mg/L时具有良好的舒张支气管作用[11]。笔者前期预实验结果显示，氨茶碱质量浓度为0.08mg/m L时解痉效果明显，故本研究以0.08mg/m L氨茶碱为阳性对照。

影响支气管平滑肌张力的主要因素有神经反射、钾离子通道的开放状态、信号传递的通路以及支气管平滑肌上受体的状态等[12]。当哮喘患者哮喘发作时，支气管平滑肌上炎症细胞破裂，产生大量ACh，从而激动气管平滑肌M受体；并且组胺H1受体数量增加，有50%的气管收缩是由His介导[13-14]。可见，ACh和His是哮喘急性发作期导致气管痉挛收缩的2种主要介质。ACh作用于M胆碱受体，His作用于H1受体，从而致使支气管平滑肌收缩，引起支气管痉挛，最终导致呼吸困难，而拮抗ACh、His可以延缓哮喘的发病[15]。本研究结果显示，神香草不同洗脱物均能不同程度地抑制ACh和His引起的豚鼠离体气管环收缩，且以神香草60%洗脱物作用效果最明显，当其质量浓度为2.56mg/m L时，对气管收缩的抑制作用与阳性对照氨茶碱相当。

综上所述，神香草60%洗脱物能够显著抑制ACh和His导致的支气管平滑肌收缩，缓解支气管痉挛。本研究为后期考察神香草60%洗脱物是否通过拮抗M胆碱受体和H1受体进而抑制支气管痉挛的作用机制研究奠定了基础。

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Effects of the Different Elutions of Hyssopus cuspidatus on Smooth M uscle Contraction of Isolated Tracheal in Guinea Pigs

YUAN Fengjuan1，2，SUN Yuhua2，HAMULATI·Hasimu2，WANG Xintang2，HE Jinhua2，MAO Yan2（1.Xinjiang Medical University Institute of TCM，Urumqi 830054，China；2.Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Materia Medical，Urumqi 830004，China）

OBJECTIVE：To investigate the effects of different elutions of Hyssopus cuspidatus on smooth muscle contraction of isolated tracheal in Guinea pigs.METHODS：Isolated tracheal rings were prepared and soaked in Krebs-Henseleit，using acetylcholine（ACh，1×10－7g/m L）or histam ine（His，1×10－6g/m L）to induce contraction of tracheal rings，then the effects of H.cuspidatus water elution and 30%，50%，60%，70%，95%ethanol elutionsw ith mass concentrations of 0.08，0.16，0.32，0.64，1.28，2.56 mg/m L on contraction of tracheal rings were respectively investigated.Contraction curves were recorded and antispasmodic rates were calculated.Tests were treated w ith saline as blank control and am inophylline（0.08 mg/m L）as positive control.RESULTS：Compared w ith blank control，0.16-2.56 mg/m L 30%，50%ethanol elution，0.32-2.56 mg/m L 60%ethanol elution and0.64-2.56 mg/m L 70%，95%ethanol elution can obviously inhibit ACh-induced contraction of tracheal rings，antispasmodic rates were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）；0.32-2.56mg/m L water elution and 30%，50%ethanol elution，0.16-2.56mg/m L 60%，70%ethanol elution and 1.28-2.56 mg/m L 95%ethanol elution can obviously inhibit His-induced contraction of tracheal rings，antispasmodic rates were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）.The effects of 2.56 mg/m L 60%ethanol elution approach to am inophylline.CONCLUSIONS：Different elutions of H.cuspidatus has certain antagonistic effect on the ACh-induced or His-induced smooth muscle contraction of isolated tracheal in Guinea pigs；60%ethanol elution shows the strongest effect，which has similar effectsw ith aminophylline at highmass concentration.

Hyssopus cuspidatus；Elution；Isolated tracheal；Acetylcholine；Histamine；Guinea pigs

R965.1

A

1001-0408（2017）13-1790-04

2016-08-23

2016-12-15）

（编辑：林 静）

国家自然科学基金资助项目（No.81560644）；新疆维吾尔自治区中医民族医药科技人才培养项目（No.2016-03-03）；新疆维吾尔自治区科技计划项目（No.201417017）；新疆医科大学研究生创新创业项目（No.CXCY 070）

＊硕士研究生。研究方向：心血管药理。电话：0991-2320296。E-mail：yfj1231_xj@163.com

#通信作者：研究员，硕士生导师。研究方向：维吾尔药有效成分分析及质量标准研究。电话：0991-2326572。E-mail：hejh1216@163. com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.18