骨通贴膏对甲醛疼痛模型大鼠的镇痛作用及机制研究Δ

李妤菲，杜婕莹，曾 森，王 璐，宋健平，王 琪，，叶俏波，张志坚，袁 捷，#（.广州中医药大学科技产业园，广州 505；.广州中医药大学中药学院，广州 5006；.桂林华润天和药业有限公司，广西桂林500；.广东新南方青蒿药业有限公司，广东梅州 50）

骨通贴膏对甲醛疼痛模型大鼠的镇痛作用及机制研究Δ

李妤菲1＊，杜婕莹2，曾 森3，王 璐3，宋健平1，王 琪1，4，叶俏波4，张志坚1，袁 捷1，2#（1.广州中医药大学科技产业园，广州 510445；2.广州中医药大学中药学院，广州 510064；3.桂林华润天和药业有限公司，广西桂林541001；4.广东新南方青蒿药业有限公司，广东梅州 514021）

目的：研究骨通贴膏对甲醛疼痛模型大鼠的镇痛作用及机制。方法：60只SD大鼠随机均分为空白组，模型组，骨通贴膏低、中、高剂量组（0.594、1.188、2.376 g/贴，含生药0.48、0.96、1.92 g）与醋酸泼尼松组（ig给药，0.005 4 g/kg，外贴基质），采用甲醛法复制大鼠疼痛模型，造模后立即给药。采用电子压痛仪测定给药1、2、3、4、6 h后各组大鼠痛阈值；给药6 h后，于腹主动脉取血0.3m L并处死大鼠，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定大鼠血浆中β-内啡肽（β-EP）、前列腺素E2（PGE2）含量，分光光度法测定大鼠血清、炎症组织中一氧化氮（NO）含量，放射免疫法检测大鼠血清、炎症组织及脑组织中P物质含量。结果：与造模前比较，模型组大鼠各个时段痛阈值均降低（P＜0.05或P＜0.01）；与空白组比较，模型组大鼠PGE2、NO、炎症组织和脑组织中P物质含量显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，骨通贴膏各剂量组大鼠给药后对应时间点的痛阈值升高，PGE2、炎症组织与脑组织中P物质含量降低（P＜0.05或P＜0.01），骨通贴膏中、高剂量组β-EP含量升高、炎症组织中NO含量降低（P＜0.05或P＜0.01），骨通贴膏高剂量组血清中NO含量降低（P＜0.05）。结论：骨通贴膏具有一定的镇痛抗炎作用，其作用机制可能与降低PGE2、NO、P物质含量，升高β-EP含量有关。

骨通贴膏；大鼠；镇痛作用；机制；β-内啡肽；前列腺素E2；一氧化氮；P物质

疼痛的产生机制尚不十分明确，现代医学对此主要有疼痛特异性与闸门控制学说[1]。中医理论则认为，疼痛主要是由气血运行不畅，气滞血瘀、痹阻经络所致。骨通贴膏含有丁公藤、麻黄、当归、干姜、乳香、三七等活血化瘀、行气止痛类药物，主要用于寒湿阻络兼血瘀证之局部关节痛症、麻木肿胀、屈伸不利等，在临床上治疗各类痛症均有较好效果[2-3]，但其具体作用机制尚未十分明确。因此，在本研究中，笔者拟建立大鼠甲醛疼痛模型，评价骨通贴膏的镇痛作用，并探讨其作用机制，以期为临床应用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

YLS-3E电子压痛仪（北京中慧天诚科技有限公司）；Sunrise酶标仪（南京华东电子集团医疗装备有限责任公司）；TP-2101电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 药品与试剂

骨痛贴膏（广西桂林华润天和药业有限公司，批号：201505，规格：7 cm×10 cm）；醋酸泼尼松片（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：130615，规格：5mg/片）；甲醛（天津市大茂化学试剂厂，批号：20131015）；一氧化氮（NO）检测试剂盒（上海闳巨实业有限公司，批号：201511）；β-内啡肽（β-EP）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（批号：C6518790162/16）、前列腺素E2（PGE2）ELISA试剂盒（批号：C2805790160/20）、P物质检测试剂盒（批号：T29016286/29）均购自武汉华美生物工程有限公司。

1.3 动物

SPF级SD大鼠60只，♂♀各半，体质量130～170 g，购自广州中医药大学实验动物中心[实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2013-0034；实验动物质量合格证号：44005800002938]。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

称定60只大鼠的体质量并采用电子压痛仪测定大鼠右后肢踝关节处给药前的痛阈值（以大鼠初始嘶叫或挣扎为标准），根据给药前痛阈值、体质量、性别将60只大鼠分层随机分为空白组，模型组（外贴基质），骨通贴膏低、中、高剂量组（外贴给药，0.594、1.188、2.376 g/贴，含生药0.48、0.96、1.92 g，中剂量贴膏为临床等效使用剂量），醋酸泼尼松组（阳性对照，ig，0.005 4 g/kg，同时外贴基质，给药剂量根据文献[4]确定），每组10只。除空白组外，各组大鼠均于右后足足跖iv 5%甲醛溶液0.1m L，诱发局部急性炎症，引发持续性疼痛，复制甲醛炎症疼痛模型。造模后，各组大鼠立即给药1次，模型组、醋酸泼尼松组大鼠外贴基质于致炎部位[4-6]。

2.2 疼痛相关指标检测

采用电子压痛仪测定给药1、2、3、4、6 h后各组大鼠右后肢踝关节处痛阈值。给药6 h后，以5%水合氯醛麻醉大鼠并于腹主动脉分别以普通管和乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采血3m L，4℃静置24 h后，离心（离心半径为8 cm，3 000 r/m in）10m in，取上清液；处死大鼠并解剖取右后肢踝关节处局部炎症组织及中脑备用。ELISA法测定大鼠血浆中β-EP、PGE2含量；分光光度法检测血清、炎症组织中一氧化氮（NO）含量；放射免疫法检测血清、炎症组织及脑组织中P物质含量。操作步骤均严格按照各试剂盒说明书进行。

2.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件对所得数据进行分析。所有数据采用±s表示。定量资料组间比较采用单因素方差分析；当组间差异性显著时，则采用LSD检验进行各组间两两比较。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠痛阈值测定结果

与造模前比较，模型组大鼠痛阈值在各个时间点均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，骨通贴膏各剂量组与醋酸泼尼松组大鼠在给药后相应时间点痛阈值均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），详见表1。

表1 各组大鼠痛阈值测定结果（±s，n＝10，g）Tab 1 Determ ination resultsof thresholds in ratsof each group（±s，n＝10，g）

表1 各组大鼠痛阈值测定结果（±s，n＝10，g）Tab 1 Determ ination resultsof thresholds in ratsof each group（±s，n＝10，g）

注：与造模前比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.beforemodeling，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；vs.modelgroup，#P＜0.05，##P＜0.01

组别模型组骨通贴膏低剂量组骨通贴膏中剂量组骨通贴膏高剂量组醋酸泼尼松组给药6 h后111.71±15.03Δ152.30±26.19##158.28±25.65##158.56±14.40##155.99±17.45##造模前133.54±30.66 133.79±37.34 133.27±26.90 133.02±10.00 133.26±19.48给药1 h后97.32±15.11ΔΔ149.63±30.66##160.17±33.09##176.37±29.81##159.47±21.80##给药2 h后114.34±21.74Δ142.08±25.65##139.64±16.28#159.93±24.76##143.51±15.13##给药3 h后97.4±12.65ΔΔ149.07±18.93##143.63±30.64##161.87±46.38##152.14±37.80##给药4 h后113.41±17.92Δ143.97±29.53#154.62±34.19##162.18±25.19##146.90±25.94##

3.2 各组大鼠血浆中PGE2、β-EP含量测定结果

与空白组比较，模型组大鼠PGE2含量显著升高（P＜0.05），β-EP含量有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，骨通贴膏各剂量组与醋酸泼尼松组大鼠PGE2含量均显著降低（P＜0.05），骨通贴膏中、高剂量组与醋酸泼尼松组大鼠β-EP含量显著升高（P＜0.05或P＜0.01），详见表2。

3.3 各组大鼠血清与炎症组织中NO含量测定结果

表2 各组大鼠血浆中PGE2、β-EP含量测定结果（±s，n＝10，pg/m L）Tab 2 Determ ination results of content of PGE2，β-EP in the blood plasma in rats of each group（±s，n＝10，pg/m L）

表2 各组大鼠血浆中PGE2、β-EP含量测定结果（±s，n＝10，pg/m L）Tab 2 Determ ination results of content of PGE2，β-EP in the blood plasma in rats of each group（±s，n＝10，pg/m L）

注：与空白组比较，＊P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05；vs.modelgroup，#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白组模型组骨通贴膏低剂量组骨通贴膏中剂量组骨通贴膏高剂量组醋酸泼尼松组PGE24.92±2.59 10.20±9.01＊4.97±4.70#5.12±2.78#4.95±5.52#4.82±1.86#β-EP 149.82±121.13 82.74±41.34 156.35±101.94 193.80±74.66#234.29±220.50##194.96±100.14#

与空白组比较，模型组大鼠血清和炎症组织中NO含量均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，骨通贴膏高剂量组、醋酸泼尼松组大鼠血清与炎症组织，骨通贴膏中剂量组大鼠炎症组织中NO含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01），详见表3。

表3 各组大鼠血清与炎症组织中NO含量测定结果（±s，n＝10，μmol/L）Tab 3 Determ ination results of content of NO in serum and inflammatory tissue in rats of each group（±s，n＝10，μmol/L）

表3 各组大鼠血清与炎症组织中NO含量测定结果（±s，n＝10，μmol/L）Tab 3 Determ ination results of content of NO in serum and inflammatory tissue in rats of each group（±s，n＝10，μmol/L）

注：与空白组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.modelgroup，#P＜0.05，##P＜0.01

炎症组织1 221.24±108.85 1 357.86±87.03＊＊1 269.70±107.97 1 209.17±103.16##1244.49±117.51#1 229.90±123.20#组别空白组模型组骨通贴膏低剂量组骨通贴膏中剂量组骨通贴膏高剂量组醋酸泼尼松组血清88.89±14.34 107.56±12.52＊91.72±29.80 91.55±12.87 88.40±23.11#83.46±21.70#

3.4 各组大鼠血清、炎症组织与脑组织中P物质含量测定结果

与空白组比较，模型组大鼠炎症组织和脑组织中P物质含量显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，骨通贴膏各剂量组和醋酸泼尼松组大鼠炎症组织与脑组织中P物质含量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）；各组大鼠血清中P物质含量比较差异无统计学意义（P＞0.05），详见表4。

4 讨论

中医理论认为疼痛的产生主要是由于风、寒、湿、热等外邪侵袭或跌打损伤导致人体内气血瘀滞、痹阻经络，如《黄帝内经·举痛论》中提出“寒气入经而稽迟”“客于脉中则气不通，故卒然而痛”，治疗以行气活血、通络止痛为主[7]。中药经皮给药制剂具有毒副作用小、疗效稳定、使用方便等优点[8]。骨通贴膏由诸多活血化瘀、行气止痛类中药组成，并采用新型聚异丁烯材料作为贴膏基质，在前期实验中，已证实其对皮肤未见毒性和致敏性、使用安全、性质稳定、药物释放性好[9]，适于临床使用。

表4 各组大鼠血清、炎症组织与脑组织中P物质含量测定结果（±s，n＝10，pg/m L）Tab 4 Determ ination results of substance P in the serum，inflammatory tissue and brain tissue in ratsof each group（±s，n＝10，pg/m L）

表4 各组大鼠血清、炎症组织与脑组织中P物质含量测定结果（±s，n＝10，pg/m L）Tab 4 Determ ination results of substance P in the serum，inflammatory tissue and brain tissue in ratsof each group（±s，n＝10，pg/m L）

注：与空白组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01Note：vs.blank group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.modelgroup，#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白组模型组骨通贴膏低剂量组骨通贴膏中剂量组骨通贴膏高剂量组醋酸泼尼松组脑组织305.95±148.14 438.44±197.33＊296.31±148.32#284.59±147.39#256.12±130.57##145.84±59.57##血清138.15±39.01 166.65±16.63 157.48±70.71 155.27±59.80 151.44±56.08 151.62±34.99炎症组织77.95±72.45 205.88±86.40＊＊143.42±66.76#135.36±62.20#110.31±67.08##139.47±55.15#

甲醛诱导的疼痛模型因其操作简单、病变直观，且造模周期短、效果显著，注射后可立即导致实验动物产生持续性疼痛，从而适用于镇痛药物的筛选与疼痛机制的研究[10]。本实验采用经典的以5%甲醛溶液注射于大鼠足跖皮下的方法复制模型，大鼠在注射后迅速出现舔足、缩腿、抬脚等反应，与文献[11-12]记载相符合。醋酸泼尼松属于糖皮质激素，有较强的抗炎作用，可有效减少组织炎症反应与炎症介质的合成与释放，故本研究选其为阳性对照药物。本实验结果表明，骨通贴膏各剂量均可有效提高甲醛致大鼠足跖肿胀痛阈值，表现出良好的镇痛作用。

现阶段，中医药的镇痛机制研究多以中医理论结合现代医学方法的模式展开，采用现代化分析技术，对与疼痛产生机制相关的指标进行检测[13-14]。PGE2是在机体受到刺激时释放的一种炎症介质，在大量释放时可直接引起疼痛或使神经根痛阈下降而引起疼痛；β-EP是一种具有吗啡样活性的神经多肽，也具有一定的镇痛活性。研究证实，调节PGE2与β-EP水平可有效缓解疼痛，如复方南星止痛膏通过增加外周血中β-EP水平、减少PGE2的含量而表现出提高大鼠足跖肿胀压痛痛阈值的作用[5]；NO作为神经递质和信息传递分子，在中枢和外周神经中均起着重要的痛觉调节作用；P物质则是在伤害性传入神经末梢时释放，能传递痛觉信息致疼痛产生的兴奋性递质。本实验结果表明，骨通贴膏能够有效调节上述各指标水平，增加β-EP，抑制PGE2、NO与P物质的合成与释放，这可能是其发挥镇痛作用的机制之一。本研究为骨通贴膏在临床的应用提供了一定的理论依据，但其更具体确切的机制则还需要进一步研究探讨。

[1] 王群，吕岩.疼痛特异性学说与闸门控制学说：争论还在持续[J].中国疼痛医学杂志，2014，20（9）：609-613.

[2] 王冠.骨通贴膏对急性软组织损伤患者疼痛的影响[J].中国医药导刊，2015，17（12）：1239-1241.

[3] 王涛然，刘群.天和骨通贴膏配合手法治疗骶髂关节痛100例[J].中国医药导刊，2015，17（8）：826-827、834.

[4] 陈荣明，姜淼，殷书梅，等.复方南星止痛膏对甲醛等致炎症疼痛模型大鼠止痛作用及c-fos表达的影响[J].世界中西医结合杂志，2008，3（8）：454-456.

[5] 胡晨，陈荣明，殷书梅，等.复方南星止痛膏的镇痛作用观察及机理探讨[J].南京中医药大学学报，2009，25（2）：140-142.

[6] 李仪奎.中药药理实验方法学[M].2版.上海：上海科学技术出版社，2006：246.

[7] 孙悦，丁成华，丁明，等.《素问·举痛论》病因病机与诊治发微[J].世界中医药，2014（3）：302-304.

[8] 杜冠峰，何宇愿，谌江城，等.中药镇痛活性成分经皮给药研究进展[J].安徽医药，2015，19（1）：1-5.

[9] 杜婕莹，曾森，王璐，等.聚异丁烯骨通贴膏经皮肤给药的安全性研究[J].中国药房，2016，27（25）：3512-3514.

[10] 张梦，骆艳丽.疼痛相关疾病动物模型研究概况[J].西部医学，2014，26（6）：814-816.

[11] FischerM，CarliG，Raboisson P，etal.The interphase of the formalin test[J].Pain，2014，155（3）：511-521.

[12] 沈立姿，房立丛，于津鹏，等.大鼠疼痛模型研究进展[J].重庆医学，2013，42（10）：1166-1169.

[13] 王晓玲，乐健，洪战英，等.中药镇痛实验的研究进展[J].药学服务与研究，2011，11（3）：213-217.

[14] 陆怡，朱元章，朱国福，等.中药镇痛机理研究概述[J].世界中医药，2015（4）：629-632.

Study on the Analgesic Effect and M echanism of Gutongtie Paste on M odel Rats w ith Formaldehyde-induced Pain

LIYufei1，DU Jieying2，ZENG Sen3，WANG Lu3，SONG Jianping1，WANG Qi1，4，YE Qiaobo4，ZHANG Zhijian1，YUAN Jie1，2（1.Sci-tech Industrial Park，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510445，China；2.School of TCM，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510064，China；3.Guilin Huarun Tianhe Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangxi Guilin 541001，China；4.Guangdong Artepharm Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangdong Meizhou 514021，China）

OBJECTIVE：To study the analgesic effect and mechanism of Gutongtie paste on model rats w ith formaldehyde-induced pain.METHODS：60 SD rats were random ly divided into blank group，model group，Gutongtie paste low-dose，medium-dose，high-dose groups（0.594，1.188.2.376 g/paste，containing crude drug 0.48，0.96，1.92 g）and prednisone acetate group（ig，0.005 4 g/kg，external bonding matrix）.Model rats w ith pain was induced by formaldehydemethod and immediately adm inistrated aftermodeling.Electronic tenderness instrumentwas adopted to determ ine the pain threshold of rats’ankle joint after administration of 1，2，3，4，6 h.After 6 h，blood sample 0.3 m L was taken from abdominal aorta then rats were sacrificed.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to determ ine theβ-endorphin（β-EP），prostaglandin E2（PGE2）contents；spectrophotometry was used to determine nitric oxide（NO）content in rats’serum and inflammatory tissue；and radioimmunoassay was adopted to detect the substance P content in rats’serum，inflammatory tissue and brain tissue.RESULTS：Compared w ith before modeling，pain thresholds in model group at each period were significantly decreased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared w ith blank group，PGE2，NO of rats，substance P content in inflammatory tissue and brain tissue in model group were significantly increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared w ith model group，pain thresholds in Gutongtie paste groups at corresponding time points were increased，PGE2and substance P contents in inflammatory tissue and brain tissue were decreased（P＜0.05 or P＜0.01）；β-EP and NO contents in serum in Gutongtie pastemedium-dose，high-dose groups（P＜0.05 or P＜0.01），NO contents in serum in Gutongtie paste high-dose group were decreased（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Gutongtie paste has a certain analgesic and anti-inflammatory effect，and themechanism may be related to reducing PGE2，NO，substance P contents，increasingβ-EP content.

Gutongtie paste；Rats；Analgesic effect；Mechanism；β-endorphin；Prostaglandin E2；Nitric oxide；Substance P

R285.5

A

1001-0408（2017）13-1766-04

2016-10-24

2017-03-13）

（编辑：刘明伟）

广东省省级科技计划项目（No.2013B090800024，2014B040404066）

＊硕士研究生。研究方向：重大疾病的中医药防治。电话：020-87479792。E-mail：416627382@qq.com

#通信作者：研究员，博士。研究方向：中药新药开发。电话：020-87479792。E-mail：466754442@qq.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.13.11