猪流行性腹泻疫苗研究进展

徐国栋

（天津市动物疫病预防控制中心 天津 300402）

猪流行性腹泻疫苗研究进展

徐国栋

（天津市动物疫病预防控制中心 天津 300402）

2011 年前后至今，猪流行性腹泻已经成为危害养猪业的最重要疫病之一，它造成哺乳仔猪和断奶仔猪的高病死率，既往研究和临床防治效果显示：通过免疫母猪使仔猪获得高水平被动免疫保护是降低仔猪群高病死率的最佳方法，故笔者对当前猪流行性腹泻常规疫苗（灭活疫苗和弱毒疫苗）和基因工程疫苗的应用效果和研究进展进行综述，以期为养殖实践中猪流行性腹泻的有效防治提供可靠依据。

猪；流行性腹泻；疫苗

猪流行性腹泻病毒 （Porcineepidemicdiarrhea virus,PEDV）属尼多病毒目、冠状病毒属，病毒核酸是具有感染性的线性单股正链无节段 RNA，全基因组5'端有帽结构（cap）,同多数冠状病毒，5'端有 Kozak序列（GUUCAUGC），3'端有 poly 尾，共有 27000～33000 个核苷酸（nt），经典毒株 PEDVCV777 株基因组全长 28033nt。病毒基因组序列从 5'～3'的 6个 ORF 分 别 是 ：ORF1a-ORF1b-S-ORF3-E-M-N,分别编码复制酶多聚蛋白 lab（pplab,非结构蛋白）、S蛋白（纤突蛋白）、ORF3 蛋白（为非结构蛋白，可能与毒力相关）、E 蛋白（小包膜蛋白，又称 sM 蛋白）、M 蛋白（膜糖蛋白）和 N 蛋白（核衣壳蛋白）。其中 S蛋白在结构蛋白中含量最高, 是最重要的 PEDV 保护性抗原。

冠状病毒属的传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritisvirus，TGEV）S 蛋白可被裂解为 S1 区和 S2 区，PEDVS 蛋白缺乏蛋白水解位点而不能被裂解，但仍被人为地划分为 S1（抗原区，l-735aa）和S2 区（膜融合区，736-1383aa）。S1 区的 3 个具有高亲 和 力 的 抗 原 表 位 是 ：S1P1（248-280aa）、S1P2（442-499aa）、S1P3 （679-742aa）,有人认为 S1 蛋白的 S1D 区 （636-789aa） 有两个 B 细胞抗原表位：S1D5 （744-759aa）、S1D6 （756-77laa）。 此 外 ，与TGEVS 抗原中和位点比较后，认为 PEDVS 基因中有 1个重要的中和抗原位点基因，该基因位点所编码的部分 S蛋白具有免疫原性，是保护性抗原，能诱导机体产生中和抗体，被称为“COE 基因”，自 5'端起可依次分为 COE1、COE2、COE3。

2011 年前后至今，由 PEDV 引起的猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）在中国大 陆、台湾地区及其它国家持续流行，新生仔猪的高病死率造成了严重的损失。就当前国内猪群中 PED 的防治效果而言，疫苗免疫仍是控制该病发生、流行和降低高病死率的最佳方法，在此，笔者就 PEDV 疫苗的应用效果及研究进展综述如下：

1 常规疫苗

1.1 灭活疫苗

1993 年，王明等用 PEDVS 株（分离自上海市某猪场）接种仔猪后取小肠及内容物，将其灭活后作为制备氢氧化铝灭活疫苗的抗原来源，该疫苗经后海穴免疫、以 PEDVCV777 株口服攻毒后发现：对 3 日龄、22 日龄仔猪接种后的主动保护率分别为77.78%（7/9）、85%（17/20），只是有的免疫猪出现了一过性腹泻；对 3 日龄仔猪的被动保护率为 97.06%（33/34）。1994 年，马思奇等将 PEDVCV777 株经Vero 细胞培养后，以 PEDVCV777 株为抗原研制成氢氧化铝灭活苗，经后海穴免疫、PEDV 沪株强毒攻毒后发现，对 3日龄仔猪接种后主动免疫保护率为85.18%（23/27）、被动免疫保护率为 85%（17/20）。1995 年，马思奇等将细胞培养的 TGEV 弱毒株和PEDVCV777 株作为抗原，研制成 TGE-PED 二联氢氧化铝细胞灭活疫苗，对实验猪后海穴免疫、PEDV沪株强毒口服攻毒后发现：对 3～5日龄仔猪接种后的主动免疫保护率为 88.89%（32/36）。

1.2 弱毒疫苗

1995 年，童昆周等将 PEDV-G1 强毒株经 Vero细胞传代，再经 pK15 和 ST 细胞交替传代后，获得了 PEDV-P83 弱毒株，将该弱毒液以口服、颈肌注射方法免疫 8～10 日龄仔猪后，以原强毒株攻击，结果两组主动保护率分别为 87.5%（13/14），100%（8/8），总保护率为 95.46%（21/22）。1998 年，佟有恩等将 PEDVCV777 株强毒株传代适应于 Vero 细胞系，此后将适应株在仔猪肾原代细胞传代克隆纯化，将获得的弱毒经实验猪后海穴免疫、PEDV 沪株强毒攻毒后发现主动免疫保护率为 95.92%（47/49）,被动免疫试验总保护率为 96.2%（76/79）。1999 年，佟有恩等用细胞培养的 PEDVCV777 株克隆弱毒株和 TEGV 华毒株克隆弱毒株制成 TEG-PED 二联弱毒疫苗，经后海穴免疫、PEDV 沪株强毒攻毒后发现，对 3 日龄仔猪的主动免疫保护率为 100%（24/24）、3～4 日龄仔猪的被动免疫保护率为 100%（25/25）。 同 年 ， 李 树 根 等 用 弱 毒 疫 苗 株PEDV-G1P83 和弱毒疫苗株 TGEV-AG1 研制成PED-TGE 二联弱毒疫苗,用该疫苗分 3 次免疫母猪（产前6周口服、产前 4周和2周肌肉注射免疫）后，用 PEDV-G1 强毒免疫母猪所产 2～3 日龄仔猪，结果发现该疫苗对 PED 的被动免疫保护率为90.84%（19/21）；用该疫苗对 8～10 日龄仔猪口服免疫，在 28 日龄时用 PEDV-G1 强毒攻击，结果发现该疫苗对 PED 的主动保护率达 100%（9/9），此后的田间试验也显示出良好的免疫效果。2013 年，王靓靓分离并保存的 PEDV（HLJBY 株）种毒制备及其特性进行了研究，通过优化胰酶含量（1～5μg/mL）和吸附时间（1.5h），在提高 Vero 中的病毒滴度，同时还降低了病毒的致病性，最终建立了适宜的 PEDV细胞培养方法。同年，高杨坤对山东省某规模场新生仔猪发生的 PED 进行了防治，方法是用 PEDV CV777 弱毒株培养液对生后仔猪灌服 2h 后再进行哺乳，结果 20 窝（共 200 头）超前免疫仔猪到 11 日龄时的成活率在 63.3%～78.3%间，20 窝 （共 200头）3日龄口服免疫的仔猪到 11日龄时的成活率在38.3%～66.7%间，由此认为发生腹泻的猪场有必要以高效价疫苗进行超前免疫。同年，田野等将分离鉴定的 PEDVGD12 株经 72 代 Vero 细胞驯化后得到 GD-R72 毒株，免疫 3 头仔猪后出现了轻微的腹泻症状，但未出现死亡，且在强毒攻击后第 3 天全部康复，推测获得了一株较理想的弱毒苗候选株。2014 年，张海明等将 PEDVCH/GDGZ/2012（广东省高州株）强毒株经 Vero 细胞 70 次传代后发现：病毒所致细胞病变明显减弱，用该病毒株以滴鼻或滴鼻加肌注方式免疫 3日龄仔猪后出现了轻微腹泻，随后用原强毒株攻击后只出现了短暂的腹泻，肠道受损程度明显轻于对照组。

2 基因工程疫苗

2.1 核酸疫苗

2011 年，斯琴高娃分别构建重组真核表达质粒pVAX1-PEDVS、pVAX1-PEDVS1、pVAX1-pIL-18（pIL-18，猪白细胞介素 -18）,以间隔 2 周、3 次股内侧肌肉注射免疫的方法进行了单组或联合组免疫试验，随后对血清 IgG 含量、外周血和脾脏 T 淋巴细胞增殖功能、外周血和脾脏T淋巴细胞毒性作用、外周血 IFN-Y 和 IL-4 表达量等免疫学指标进行了测定，结果发现构建的 S组和联合免疫组多数免疫指标都高于 S1 组,联合免疫组疫苗诱导了更高的细胞和体液免疫应答，认为 pIL-18 基因可作为PEDVS 抗原基因分子佐剂。同年，孟凡丹分别构建了 TGEVS1 基因 （S 基因 N 端部分，2106bp）和PEDVS1 基 因 （CV777 株 S 基 因 1-2367bp）的pIRES-T1-P1 二 联 核 酸 疫 苗 、TGEVS1 基 因 和PEDVS 全长基因（4149bp）的 pIRES-T1-P2 二联核酸疫苗，以间隔 14d、连续 3 次在后肢双内侧股四头肌处注射免疫 6～8周龄昆明小鼠，用淋巴细胞增殖实验、流式细胞术、ELISA 等方法对小鼠机体的动态免疫学指标进行了测定，结果发现：两种联苗均能诱导小鼠机体产生明显体液免疫和细胞免疫，而以 T1-P2 疫苗诱导的免疫应答较强。

2.2 病毒载体疫苗

2007 年，韦显凯构建 3 个可表达 PEDVS 蛋白不同位点的重组腺病毒,分别命名为 rAD-S1-638、rAD-S498-368 、rAD-S639-1384，将重组病毒连续2 次、相隔 14d 皮下免疫雌性小鼠，以 ELISA、中和试验、脾细胞转化试验测定免疫小鼠的免疫应答，结果发现：脾细胞增殖反应较弱，但血清抗体（尤其是 rAD-S498-368 组）较高。2012 年，焦茂兴等分别构建了含有 PEDVsM、M 和 S 基因的重组腺病毒，3种腺病毒共感染 Vero 细胞后，取表达上清液以肌注或口服免疫小鼠，再以 Westernblotting 法测定免疫小鼠血清后发现两种免疫方式均可诱导抗体产生，即 PEDV 的 sM、M 和 S 基因能在靶细胞内表达并保持其免疫原性。2013 年，武存霞参考 NCBI数据库中公布的 PEDVJS-2004-2 株 S 蛋白基因序列,构建了能够表达 S1 基因片段的重组猪痘病毒rSPV-Sl，分别在 1、14、28d 用该疫苗注射免疫 ICR小鼠，以病毒中和试验在免疫小鼠体内检测到抗PEDV抗体。

2.3 细菌载体疫苗

2．3．1 乳酸菌疫苗 2008 年，葛俊伟用 8 个构建的表达 PEDV 免疫保护性抗原蛋白的重组乳杆菌以每 2周 1 次、每次持续 3d、连续 3 次口服的方法免疫小鼠，用 ELISA 方法检测小鼠新鲜粪便、血液、眼冲洗物、鼻腔冲洗液、外生殖道冲洗液等样品中的 slgA和血清中的 IgG 水平，发现免疫后均产生了高水平的抗体，通过淋巴细胞增殖试验和细胞因子测定发现疫苗同时诱导了明显的细胞免疫，且发现构建的细胞表面表达型疫苗比分泌表达型疫苗能诱导更好的免疫应答，两类疫苗均能刺激小鼠高水平的黏膜免疫和细胞免疫应答。同年，董丽娜自疑似 PED病猪肠病料中扩增到长度为 50lbp 的 PEDVCOE 基因，其序列与 PEDVCV777 株同源性达 99.4%，在此基础上构建了可表达 COE 基因的重组乳酸乳球菌pNZ8149-COENZ3900，用 Westernblot和间接免疫荧光方法检测发现：重组菌中的目的蛋白定位在菌体表面，具有反应原性。2009 年，胡桂学等将董丽娜等制备的重组乳酸菌诱导培养，再分别用菌液以间隔 2周、连续 3次口服的方法对 7周龄仔猪和妊娠80d 的母猪进行免疫，用间接 ELISA 法对免疫后15～20d 的仔猪血清 IgG 和肠黏膜 SIgA、母猪生产后初乳中 SIgA 进行测定，结果发现相关抗体水平明显升高。2011 年，董浩等将构建的 PEDV-COE-GFP NZ3900 重组乳酸乳球菌经口服途径接种 6～8 周龄、体重约 20g雄性 BALB／c 小鼠，以免疫荧光法观察黏膜涂片该菌在胃肠黏膜的定植情况，结果发现该菌在不同肠段分布并不均匀，以胃、结肠内菌量较高，但已经定植在胃肠黏膜不同部位菌量不随时间延长发生变化。同年，汪淼等将构建可以表达与 PEDVCOE 基因位置相同的 ps420（1495～l914）bp 基因重组乳酸乳球菌，将该重组菌以间隔 14d连续 3 次、每次连续 3d 灌服家兔，再用中和试验检测家兔血清中和 IgG，发现该重组菌诱导较高水平的体 液 免 疫 应答。 2013 年， 訾玉 华 以 PEDV CH-GZH 株（江西赣州）S 基因为靶基因，构建重组乳酸菌 pMG36n/COE1NZ9000、pMG36n/COE2NZ9000、pMG36n/COE3NZ9000,经 SDS-PAGE 凝胶电泳检测发现，重组菌均可表达相关抗原。同年，赵德等构建可表达 PEDVS 基因保护性抗原片段 C-COE 基因的重组乳酸菌，将诱导表达的重组乳酸菌按连续3次、间隔 1 周口服或皮下注射免疫 SPF 级雌性Balb/c 小鼠，经 ELISA 方法检测小鼠血清抗体及IFN-γ 含量，结果发现重组菌诱导了体液免疫和细胞免疫：血清抗体和 IFN-γ 水平较高，且口服组指标均高于注射组（P＜0.05）。2014 年，徐波等构建了TGEV、PEDV 融合 S 基因重组质粒 pUCm-T-TPs，在此基础上构建了重组乳酸乳球菌 L.lactisNZ9000/ pRNA48-TPs，使融合基因 TPs得以表达，并对乳酸乳球菌细胞总蛋白进行了提取，其后，分别用口服重组菌液和注射重组蛋白的方法免疫日本大耳白兔，口服时按 2 次 /周、连续 4 周灌胃诱导表达 TPs基因的重组菌菌液方法进行，注射时按 1 次 /周、连续3周肌肉注射弗氏完全佐剂或不完全佐剂加重组表达蛋白方法进行，对免疫兔血清用 Western-blot方法进行检测，结果发现口服组、注射组兔体内均产生了 TPs蛋白抗体。

2．3．2 减毒沙门氏菌疫苗 2011 年，徐丽丽自腹泻猪粪便中扩增到 PEDVCOE 基因和 SD 基因，构建了重组沙门氏菌 C501-COE、C501-SD，目的蛋白可以在重组菌中分泌表达，分别将重组菌以口服或注射的方式免疫 BalB/c 小鼠，并在 2 周后对部分免疫小鼠进行了强化免疫，通过对血清 IgG、肠道黏膜sIgA、脾细胞分泌的 IFN-γ 水平检测发现：小鼠体内产生了体液免疫和细胞免疫。2012 年，廖晓丹用四川分离株 PEDV(SC-L 株)和 TGEV（SC-H 株）作为种毒，构建了携带 PEDVS1 基因、TGEVS 基因、同时携带 PEDVS1 和 TGEVS 基因的三种重组减毒沙门氏菌疫苗，对小鼠连续 3次口服免疫 14d后，以间接 ELISA 方法检测体内两种抗原（PEDVS1蛋白和 TGEVS 蛋白） 的血清 IgG 和肠道 sIgA 水平，结果发现三种疫苗均可诱导免疫小鼠产生高水平的抗体，且发现单基因混合免疫组抗体水平较高。同年，唐莹参照 PEDVCV777 株序列，构建了减毒沙门氏菌递呈的 PEDVS/M 双基因核酸疫苗SL7207（pVAXD-PSl-PM）和单基因核酸疫苗SL7207（pVAXD-PSl）、SL7207（pVAXD-PM），分别 将 疫 苗以 2 周 1 次、连续 3 次口服免疫小鼠后，发现部分小鼠免疫 1～3d 后出现食欲降低、精神不振和扎堆等症状,但剖检未见实质器官出现异常病变。以间接ELISA 法对疫苗诱导的 PEDV 血清 IgG、肠道 sIgA进行检测，结果发现免疫 4～6周后抗体水平持续上升，6 周时达到最高，在整个免疫过程中，混合单基因疫苗免疫组免疫学指标始终优于双基因组免疫组，同时，通过对 γ- 干扰素的检测发现两种免疫方法均诱导了细胞免疫。同年，任玉鹏参照CV777 株序列，构建了携带 M、N 双基因共表达载体的猪霍乱减毒沙门氏菌活载体疫苗，分别以间隔2周，连续 3 次口服的方法免疫小鼠，用 ELISA 方法分别检测血清中 IgG、粪便中 sIgA、血清中 γ- 干扰素和白介素 4的水平，结果发现第 21天起血清抗体水平明显升高，但未能达到商品灭活疫苗所激发的抗体水平，疫苗可诱导黏膜免疫，同时，血清中γ-干扰素和白介素4两种细胞因子都显著升高,即该疫苗同时诱导了细胞免疫。2014 年，QigaiHe将自 PEDVCV777 株扩增的 SD 和 COE 基因在质粒 pYA3493 上表达后，获得了两种可以在菌体表面表达目的基因的重组减毒沙门氏菌，分别命名为C501-COE 和 C501-SD, 将上述两种菌以注射或口服方式免疫小鼠，结果发现两种疫苗在不同免疫途径下均可诱导小鼠机体产生体液免疫（黏膜 IgA 和血清 IgG）和细胞免疫，只是肌肉注射免疫后 IgG 滴度较高，口服免疫后 IgA 滴度较高,重组疫苗应用在养殖生产中未引起免疫猪的副作用，可将流行 PED的猪场猪群病死率从原来的 80%降低到 20%～50%，腹泻率从原来的 100%下降至 18%～30%，由此认为这两种重组菌可作为候选疫苗。

2．3．3 大肠杆菌载体疫苗 2013 年，杨榕等自安徽省某猪场采集的病料扩增出 PEDVCOE 基因, 在原核表达载 pET-32α 中克隆后，经大肠杆菌 Rosetta 诱导表达，得到了与 COE 基因相应的具有免疫活性的重组蛋白。

1）国内常规疫苗研究和应用时间较长，前期动物实验显示出良好的免疫效果，但在 2011 年后，养殖一线的从业者即便反复应用灭活疫苗或弱毒株疫苗免疫母猪群，也不能为新生仔猪提供强有力的被动免疫保护，以致新生仔猪 PED 的发生愈演愈烈。其原因可能与下述因素有关：①近期流行的PEDV 确实发生较大的变异，经典毒株制成的疫苗不能提供全面免疫保护；②现有疫苗抗原含量偏低；③猪群存在较严重的免疫抑制，现有疫苗不能诱导强有力的免疫。

2）当前基因工程疫苗尚处于研究阶段，多数基因工程疫苗需要持续长时间、多次接种才能诱导动物机体产生有效的免疫力，这在养殖一线是不便捷的，而当前新生仔猪发生腹泻后将迅速脱水致死，显然对生后仔猪免疫此类疫苗来达到有效防治目的并不及时，此外，使用此类疫苗免疫母猪使生后仔猪获得被动免疫的动物试验研究较少，因此此类疫苗大量应用于养殖一线尚待时日。笔者认为：疫苗中充足的抗原含量是保证良好免疫效果的最重要因素，例如高抗原含量的灭活疫苗，即便颈部肌肉免疫母猪，也可使新生仔猪获得强有力的被动免疫保护，同时还可避免后海穴免疫造成的母猪注射部位的脓肿。

（略）

（配图来自网络）

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.02.001