实时荧光定量PCR检测人脑胶质瘤、髓母细胞瘤中SAMD14的表达▲

龚范勇 葛盈盈 肖绍文*

(1 广西医科大学第一附属医院，南宁市 530021；2 广西医科大学基础医学院，广西高校基础医学重点实验室，南宁市 530021)

·论 著·

实时荧光定量PCR检测人脑胶质瘤、髓母细胞瘤中SAMD14的表达▲

龚范勇1葛盈盈2肖绍文1*

(1 广西医科大学第一附属医院，南宁市 530021；2 广西医科大学基础医学院，广西高校基础医学重点实验室，南宁市 530021)

目的 分析人胶质瘤和髓母细胞瘤中SAMD 14 mRNA的表达情况及其与临床参数间的关系。方法 使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测10例正常人脑组织、24例胶质瘤患者和11例髓母细胞瘤患者肿瘤组织中SAMD 14 mRNA的相对表达量，分析其表达与患者临床病理学特征的关系。结果 胶质瘤、髓母细胞瘤组织中SAMD 14 mRNA的表达水平低于正常脑组织，胶质瘤中SAMD 14 mRNA的表达水平高于髓母细胞瘤组织(P<0.05)。SAMD 14 mRNA相对表达量与性别、年龄、肿瘤直径和KPS评分等因素无关(P>0.05)。结论 SAMD 14 mRNA的低表达可能与胶质瘤和髓母细胞瘤的发生、发展有关。

胶质瘤；髓母细胞瘤；SAMD 14；荧光定量PCR

神经胶质瘤简称胶质瘤，也称为胶质细胞瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半。根据世界卫生组织(WHO)对中枢神经系统肿瘤的最新分类系统，胶质瘤被分为Ⅰ～Ⅳ四个等级，其中Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤恶性度较高，患者平均存活时间仅为1年左右[1]。髓母细胞瘤是一种常见的儿童颅内肿瘤，偶发于成年人，为WHO IV级高恶性肿瘤。目前，在临床上针对胶质瘤及髓母细胞瘤的治疗主要以外科手术切除为主，术后结合放疗、化疗等辅助手段，但效果欠佳，特别是Ⅲ～Ⅳ级高恶性肿瘤患者的预后不理想。近年来，随着分子遗传学、分子生物学的发展，针对胶质瘤的诊断、鉴别诊断和靶向治疗分子标记物的研究取得较大进展，IDH1、MGMT等各类标记物被大量用于脑肿瘤的临床研究以及相关临床试验[2-3]。

SAMD 14(sterile alpha motif domain containing 14)为近年来发现的一种抑癌基因，位于17q 21.33染色体上。SAMD 14编码蛋白由417个氨基酸组成。有报道显示，SAMD 14在肺癌中有抑癌作用[4]，并参与血液系统造血功能调控[5]，其余功能尚不清楚。目前为止，SAMD 14在脑肿瘤中的功能尚无文献报道。本实验主要从基因水平上研究SAMD 14在成人胶质瘤组织和成人髓母细胞瘤组织的表达情况，探讨SAMD 14作为肿瘤分子标记物的可能及SAMD 14表达情况与胶质瘤、髓母细胞瘤临床参数间的关系，为进一步开展针对SAMD 14的分子作用机制研究提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集广西医科大学第一附属医院神经外科一病区2009年1月至2010年12月住院治疗的45例经开颅手术切除的脑肿瘤组织和正常组织，诊断均经病理学确诊。其中正常脑组织10例，男6例，女4例；脑肿瘤组织35例，男22例，女13例。脑肿瘤组织病例年龄18～76(39.26±14.85)岁。按2007年第4版《WHO中枢神经系统肿瘤分类》，其中Ⅰ～Ⅱ级神经胶质瘤12例，Ⅲ～Ⅳ级神经胶质瘤12例，Ⅲ～Ⅳ级髓母细胞瘤11例。脑肿瘤组织均取自原发灶，获得标本后立即放入去RNA酶和DNA酶的1.5 mL EP管中，置于液氮暂时保存，随后立即转至-80℃冰箱低温保存。所有病例均全切肿瘤，术前均未行放疗和化疗。本实验经过广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 主要仪器和试剂 LightCycler480II荧光定量PCR仪(上海罗氏制药有限公司)，OSE-260超微量分光光度计(北京天根生化科技有限公司)，5810R台式多功能冷冻高速离心机(德国Eppndorf公司)，-80℃超低温冰箱(海尔公司)，高速分散均质机(上海标本模型厂)；Takara 总RNA提取试剂盒购自南宁科迪生物技术有限公司，总RNA抽提试剂及逆转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；LightCycler480 SYBR Green I Masster荧光定量PCR试剂盒购自上海罗氏制药有限公司。

1.3 引物的设计与合成 参照文献[1]，并根据Genebank中人类SAMD 14、GAPDH基因的cDNA序列，应用引物设计软件Primer 5设计引物，引物由上海英潍捷基有限公司合成。SAMD 14引物序列：上游5′-AGACGCTGAAGATGACCGATG-3′，下游5′- ACGGGTTCTCGGAGCTTTG-3′。内参GAPDH引物序列：上游5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游为5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.4 实验方法 取50～60 mg组织标本于1 mL总RNA抽提试剂中，使用高速分散均质机打碎组织，随后依照RNA提取试剂盒说明书提取组织中总RNA，用超微量分光光度计检测浓度，并测量样品在260 nm和280 nm下的吸光光度，计算D260/D280，所有标本的比值均在1.8～2.0之间。检测RNA浓度及纯度后按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，以GAPDH为内参，在LightCycler480II荧光定量PCR仪上进行检测。扩增体系20 μL：SYBR Green I Masster 10 μL，上下游引物各2 μL，RNA-free H2O 6.8 μL，cDNA模板2 μL。反应条件：预变性95℃ 5 min；变性95℃10 s，退火60℃ 10 s，延伸72℃ 10 s，共计45个循环。每个样本均设置3个副孔。

1.5 统计学方法 实验数据应用 △△CT法进行处理，计算各样本△CT 值，以2-△△Ct值来表示肿瘤组织目的基因表达量相对正常组织目的基因表达量的相对倍数。采用SPSS 17.0统计学软件进行统计处理，计量资料采用(x±s)表示，两样本均数的比较采用t检验。临床参数分析采用t检验和秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SAMD 14mRNA在正常脑组织和肿瘤中的表达情况 定量PCR结果如图1。SAMD 14 mRNA在正常脑组织中的相对表达量高于肿瘤组织中的相对表达量，平均约为所有胶质瘤组织相对表达量的3.2倍、WHO Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组织相对表达量的2.6倍、WHO Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织相对表达量的4.1倍和髓母细胞瘤的11.2倍，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，SAMD 14 mRNA在胶质瘤组织中的相对表达量亦高于其在髓母细胞瘤组织中的相对表达量，均值约为髓母细胞瘤组织相对表达量的3.5倍。并且SAMD 14 mRNA在WHO Ⅰ～Ⅱ级和WHO Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织中的相对表达量均高于其在髓母细胞瘤组织中的相对表达量，差异有统计学意义(P<0.05)。此外，定量PCR结果显示SAMD 14 mRNA在WHO Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组织的相对表达量高于其在WHO Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤组织相对表达量，但差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2。

图1 实时荧光定量PCR熔解峰

图2 实时荧光定量PCR检测各组织中SAMD 14 mRNA的表达

注：A：SAMD 14 mRNA在正常脑和肿瘤组织中表达情况比较；B：SAMD 14 mRNA在正常脑和不同分级胶质瘤组织中表达情况比较；C：SAMD 14 mRNA在髓母细胞瘤和胶质瘤组织中表达情况比较；D：SAMD 14 mRNA在髓母细胞瘤和不同分级胶质瘤组织中表达情况比较；E：SAMD 14 mRNA在不同分级胶质瘤组织中表达情况比较。

2.2 SAMD 14 mRNA的表达与临床参数的关系 在所纳入胶质瘤病例及髓母细胞瘤病例中，SAMD 14 mRNA相对表达量与患者的性别、年龄、肿瘤直径和KPS评分等因素均无关(P>0.05)。见表1、表2。

表1SAMD 14 mRNA的表达和胶质瘤临床特征的关系

表2 SAMD 14 mRNA的表达和髓母细胞瘤临床特征的关系

3 讨 论

随着分子生物学和分子遗传学的发展，目前认为胶质瘤、髓母细胞瘤的发生包括了细胞周期调控、细胞信号传导、细胞分化等多种机制的相互作用，涉及多个突变基因的积累、原癌基因的激活、抑癌基因的失活。因此，对肿瘤临床诊断治疗相关分子标记物的筛选愈来愈重要。

本实验结果显示：在mRNA水平，SAMD 14在胶质瘤、髓母细胞瘤中的相对表达量低于在正常脑中的相对表达量。同时在髓母细胞瘤中SAMD 14相对表达量低于胶质瘤。对胶质瘤、髓母细胞瘤病例进行分级比较后发现，SAMD 14 mRNA表达水平与患者年龄、性别、肿瘤大小等均不相关。并且，在胶质瘤中，随着WHO分级恶性程度提高，SAMD 14表达有下降趋势，提示SAMD 14受抑制可能与胶质瘤、髓母细胞瘤的发生有关，SAMD 14的受抑制可能增强肿瘤的侵袭，增加肿瘤复发风险，表明SAMD 14有作为胶质瘤分化程度指标的潜力。

作为一种抑癌基因，SAMD 14位于17q 21.33染色体上，其编码蛋白含有一种特殊的蛋白结构域—SAM域[6]，该结构域约含有70余个氨基酸残基，是一个具有较高进化保守性的蛋白结构域，在真核细胞胞质、胞核及胞膜广泛分布，参与细胞发育等多种细胞功能调控。SAM域可以通过与多种蛋白、RNA相结合，在多种分子通路中发挥作用。比如， Tankyrase-1 (TNKS 1)中的SAM域突变会阻碍TNKS 1与Axin 1等其他信号因子结合，进而抑制TNSK1参与调控WNT信号通路[7]；神经节苷脂GM 1可与P 63上的SAM域相结合，调控人表皮细胞分化[8]。

在肺癌组织中SAMD 14 mRNA相对表达量低于在对应癌旁组织和其他正常肺组织的相对表达量，并且在A 549、Calu-3等肺癌细胞系中SAMD 14 mRNA相对表达量亦明显下调。由于SAMD 14启动子区有约70%CG含量，因此Sun等[4]针对肺癌患者肿瘤-瘤旁组织标本、肺癌细胞系等不同样本的这一特殊区域进行了亚硫酸氢盐处理后测序和甲基化特异性PCR实验，结果发现相对于瘤旁组织及正常肺组织，SAMD 14启动子区在肺癌组织和肺癌细胞系样本中有明显的异常高甲基化。所以，SAMD 14在肿瘤发生发展中的作用很可能与其启动子区的异常甲基化有关—SAMD 14启动子区异常甲基化导致SAMD 14表达下调，从而使它的抑癌功能无法正常发挥。Shen等的研究也证实这一现象[9]。而近年对胶质瘤、髓母细胞瘤的表观遗传学研究也发现，MGMT、BATF 2等部分肿瘤相关基因参与肿瘤形成的机制与他们启动子区异常甲基化有关，这些基因的不同甲基化程度也可以配合磁共振等影像学检查，其结果在一定程度上揭示不同患者预后情况[10-12]。因此，SAMD 14在胶质瘤、髓母细胞瘤中的功能抑制有可能与其启动子区异常甲基化有关，具体机制还有待进一步研究。

综上所述， SAMD 14 mRNA表达受抑制对胶质瘤、髓母细胞瘤的发生、发展具有一定的影响和促进作用。SAMD 14有作为反映胶质瘤恶性程度标记物的潜力，为肿瘤治疗的研究提供了新的思路和靶点。由于肿瘤发生为涉及多种机制、多种基因相互作用的结果，SAMD 14在胶质瘤、髓母细胞瘤的具体机制还有待进一步研究。

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Expression of SAMD14 in human glioma and medulloblastoma detected by quantitative real time PCR

GONGFanyong1,GEYingying2,XIAOShaowen1*

(1TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning,Guangxi530021，China; 2SchoolofBasicMedicalSciences,GuangxiMedicalUniversity.GuangxiKeyLaboratoryofBasicMedicalSciences,Nanning,Guangxi530021,China)

Objective To analyze the expression of SAMD 14 mRNA in human glioma and medulloblastoma，and to study their association with clinical features of glioma and medulloblastoma. Methods The expression of SAMD 14 mRNA was detected in 10 human normal brain tissues, 24 glioma tissues and 11 medulloblastoma tissues by qRT-PCR, then the relationship of their expression and clinical features were analyzed. Results The expression of SAMD 14 mRNA was lower in glioma and medulloblastoma tissues than in human normal brain tissues. The expression of SMAD14 mRNA was higher in glioma tissues than in medulloblastoma tissues(P<0.05). There is no significant difference between the expression of SMAD14 mRNA and clinical features(Sex, age, tumor diameter and KPS scores,etc). Conclusion The low expression of SAMD 14 were possibly related to tumorigenesis of glioma and medulloblastoma.

Glioma; Medulloblastoma;SAMD 14;qRT-PCR

国家自然科学基金(编号：81460382；81560408)；广西自然科学基金(编号：2014GXNSFAA118231；2014GXNSFAA118089)；广西医科大学青年科学基金(编号：GXMUYSF201409)

R 739.41

A

1673-6575(2017)02-0162-05

10.11864/j.issn.1673.2017.02.02

2016-12-18

2017-02-15)

*通信作者