不同品种芡实种仁蛋白质亚基组成及氨基酸分析

陈 静,陈志宏,张 汆,*,柏 钰,王 梅

(1.滁州职业技术学院食品与环境工程系,安徽滁州 239000; 2.安徽省热敏性物料加工工程技术研究中心,安徽滁州 239000)

不同品种芡实种仁蛋白质亚基组成及氨基酸分析

陈 静1,2,陈志宏2,张 汆2,*,柏 钰2,王 梅2

(1.滁州职业技术学院食品与环境工程系,安徽滁州 239000; 2.安徽省热敏性物料加工工程技术研究中心,安徽滁州 239000)

本实验选择3个不同品种、2种不同成熟度的5个芡实种仁样品,通过SDS-PAGE法及氨基酸分析仪法对其蛋白质亚基结构和氨基酸组成进行了初步分析。结果表明,刺芡(成熟)种仁蛋白质含量显著高于苏芡(成熟)(p≤0.05),且刺芡(成熟)种仁蛋白质中必需氨基酸、甜味和鲜味氨基酸含量也高于苏芡(成熟),说明刺芡在营养和口感上要优于苏芡。SDS-PAGE的分析结果显示,芡种仁总蛋白中分离出约20条谱带,相对分子质量在16.24～82.04 kDa之间。其中分子量35.9 kDa左右基含量最高,是芡实总蛋白中最主要亚基。芡实蛋白质中的水溶性蛋白含量很少,且不同成熟度样品间差异很大,苏芡(嫩)和淮芡(嫩)中均未检出水溶性蛋白。品种间醇溶性蛋白质亚基组成差异较大,碱溶性蛋白质亚基及分子量分布品种间和成熟度间差异不大。

芡种仁蛋白质,亚基组成,SDS-PAGE,氨基酸分析

芡实(Euryaleferox)别名鸡头米、鸡头莲等,为睡莲科植物芡(EuryaleferoxSalisb.)的干燥成熟种仁。芡实在我国分布广泛,其主产区为江苏、安徽、湖北、江西和湖南等地[1]。作为一种药食同源的传统中药材,芡实具有补脾止泻、益肾固精及祛湿止带等功效,可用于治疗肾病和脾脏功能减退等[2-3]。芡实可食部分为干燥成熟种仁,含有丰富的碳水化合物、蛋白质、维生素和矿物质等多种营养成分[4]。研究表明,芡实具有较强的抗氧化[5]、抗疲劳[6]、提高免疫力[7]、降血糖和降血脂[8]等多种生理保健功效。

目前,关于芡实的研究多集中于其多糖及多酚等成分的分离提取及功能性研究[9-10],但对于芡实中蛋白质的研究较少,不同品种间芡实所含蛋白分子结构的差异性、结构与功能性之间的关系等还不清楚。李成良等[11]的研究显示,芡实所含的氨基酸中含有6种人体必需氨基酸及2种幼儿必需氨基酸。张晓云等[12]采用超声波辅助碱法提取芡实中的蛋白质,在单因素和正交实验基础上获得了较好的芡实蛋白提取工艺。俞乐等[13]对4个不同产地芡实种仁中蛋白质的差异性进行了研究,发现不同产地芡实种仁的总蛋白质含量没有显著差异,但所提取的4种不同蛋白(清蛋白、醇蛋白、谷蛋白和球蛋白)的含量存在显著性差异,并采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析了不同产地芡实蛋白亚基的差异性。陈蓉等[14]对15个产地的芡实进行氨基酸组成与营养价值评价,发现不同产地芡实所含的某些氨基酸含量差异较明显。

芡实种仁中一般含有约9%～12%的蛋白质[16],蛋白质的营养价值不仅与其含量、氨基酸组成及蛋白质消化产物中的活性肽等有关,还可能与芡实品种以及成熟度有关。而有关不同品种(刺芡、苏芡、淮芡)、不同成熟度(成熟、嫩)间芡实蛋白结构方面的差异性,文献报道不多。

文中通过对芡实中蛋白质亚基组成和蛋白质种类进行分析,拟探寻不同品种、不同成熟度芡实蛋白结构间的差异性。文中选用3个不同品种、2种成熟度的5个芡实种仁样品,对其中的水溶性蛋白、醇溶性蛋白和碱溶性蛋白组分的亚基组成和氨基酸进行分析,以期为芡实品种鉴别提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

5个芡实种仁样品:刺芡(成熟),苏芡(成熟),刺芡(嫩),苏芡(嫩),淮芡(嫩),其中,刺芡属于北芡,苏芡和淮芡属于南芡 均采自安徽省境内芡实种植基地;氢氧化钠、甲醇、乙酸、无水碳酸钠、盐酸和硫酸钾等 均为分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;四甲基乙二胺(TEMED)、溴酚蓝、十二烷基硫酸钠(SDS,电泳级)、浓硫酸、硫酸铜和丙三醇等 均为分析,纯国药集团化学试剂有限公司;考马斯亮蓝R250、二硫代苏糖醇(DTT) 购自上海金穗生物科技有限公司;琼脂粉(生化试剂级) 购自上海宇涵生物科技有限公司;甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、丙烯酰胺 均为电泳级,阿拉丁试剂(上海)有限公司;三羟甲基氨基甲烷(Tris base,电泳级) 购自北京拜尔迪生物技术有限公司;甘氨酸(Gly,分子生化级) 上海拜力生物科技有限公司;低分子量标准蛋白质Marker(14.4～97.4 kDa) 购自中国科学院上海生物细胞研究所。

L550台式低速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;FD-4型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;DYCZ-24DN型电泳仪 北京市六一仪器厂;L8900型氨基酸分析仪 日本日立公司;YC-820型五谷杂粮磨粉机 广州金本机械设备有限公司。

1.2 实验方法

本条第二款规定，具有高等院校专科以上学历的公民，可以参加评估师资格全国统一考试。根据这一规定，在学历方面，只要具有高等院校专科以上学历的公民，就可以参加评估师资格全国统一考试。资产评估是评定、估算资产价值的专业服务，既需要专业知识，更需要实践经验，因此，参加评估师资格考试在学历方面的要求不宜定得过高，规定具备高等院校专科以上学历的公民就可以参加考试，有利于通过评估师资格考试吸引和锁定更多人才。需要注意的是，除房地产估价师考试外，评估师资格全国统一考试是水平评价性质，不是行业准入考试，公民可以自愿参加。有关部门现有的规定与本法规定不一致的，应当在本法实施前及时根据本法作出修改。

1.2.1 芡实种子的预处理 干燥后的芡实种子手工去壳后,将种壳和种仁分离,将种仁用粉碎机粉碎(过100目筛)后,装入塑料自封袋内,在-18 ℃下储存,备用。

1.2.2 芡实种仁主要组分分析 水分含量的测定,参照GB 5009.3-2010[17],采用直接干燥法进行测定。蛋白质含量的测定,参照GB 50095-2010[18],采用凯氏定氮法进行测定。淀粉含量的测定,参照GB/T 5009.9-2008[19]进行分析测定。总灰分含量的测定,参照GB 5009.4-2010[20]进行分析测定。

1.2.3 芡实种仁中蛋白质的分离提取 称取20 g芡实粉,加入200 mL蒸馏水,在40 ℃水浴下磁力搅拌30 min后离心(4000 r/min,10 min),取上清液,沉淀重复提取一次,合并上清液,经透析、冷冻干燥后得到水溶性蛋白样品。

提取水溶性蛋白后的残渣再依次用200 mL的70%～75%乙醇溶液和0.1 mol/L NaOH溶液重复上述操作,所得提取液依次为醇溶蛋白和碱溶蛋白样品[21-22]。

1.2.4 SDS-PAGE电泳分析

1.2.4.1 溶液配制 分别配制电泳用样品溶解液、电泳缓冲液、染色液以及丙烯酰胺溶液等试剂,备用[23-25]。

1.2.4.2 蛋白质样品制备 a.芡实总蛋白:取10 mg芡实粉,加入1 mL样品溶解液,振荡30 min后,沸水浴5 min,取出冷却至室温,高速离心(15000 r/min,15 min),取上清液备用。

b.其他蛋白质:分别取1 mg芡实水溶、醇溶和碱溶蛋白样品于5 mL离心管中,分别加入1 mL样品溶解液,振荡30 min后,沸水浴5 min,取出冷却至室温,高速离心(15000 r/min,15 min),取上清液备用。

表1 不同芡实样品主要营养成分分析Table 1 Analysis of main nutritional components in different varieties of Euryale ferox seed kernels

注:同一行数据中,标有不同小写字母的数据间在α=0.05显著水平存在显著性差异,标有相同字母表示无显著性差异。

表2 不同芡实样品总蛋白质亚基分子量分布Table 2 The molecular weight distribution of total protein subunits in different varieties of the Euryale ferox seed kernels

c.电泳分析:制备分离胶以及浓缩胶,然后将制备好的蛋白质样品溶液加入泳道,调节合适参数对样品进行电泳分析,得蛋白质样品电泳凝胶[23-25]。

1.2.5 芡实蛋白氨基酸组成分析 参照GB/T 5009.124-2003[26]方法,采用L-8900氨基酸分析仪对芡实蛋白样品中的氨基酸组成进行分析。

1.3 数据处理

所有样品均重复测定3次,结果以平均值±标准差(X±SD)表示,并采用SPSS分析软件进行数据处理和结果分析。

2 结果与分析

2.1 不同芡实样品营养组分分析

不同芡实样品中蛋白质含量如表1所示。结果显示,5个样品中,2种成熟样品的蛋白质含量均高于其他3种生长期芡实,最高的是刺芡(成熟),达13.72%,最低的是苏芡(嫩),除了刺芡(嫩)与淮芡(嫩)差异不显著(p>0.05)外,其他样品间蛋白质含量差异显著(p≤0.05)。说明成熟种子中蛋白质组分累计完全,而生长期种子中淀粉、蛋白质等大分子的累计过程还未结束。

不同芡实样品中的淀粉含量变化与蛋白质结果基本一致。总灰分含量以2种成熟芡实种仁中含量较高,品种间差异显著(p≤0.05),生长期种子中刺芡(嫩)最高,显著高于苏芡(嫩)和淮芡(嫩)。因此,芡实种子的具体收获时间要根据种子的用途来安排,一般留种或以干制芡实米加工的应在入冬后收获,以保证种仁中各种营养组分的充分积累。而芡实嫩米加工时要准确把握采收期,果实发育期不能超过两周,否则会因淀粉含量过高而影响产品口感[27]。

2.2 不同芡实样品蛋白质组成分析

2.2.1 芡实种仁总蛋白质 不同芡实样品中总蛋白质的SDS-PAGE图谱及分子量分布如图1和表2所示。结果显示,不同芡实样品总蛋白质的亚基数量和相对分子量分布都非常接近,没有发现差异性谱带。在本实验条件下,共分离出12～20条谱带,其中比较清楚的12条谱带对应的相对分子量列在表2中。芡实种仁总蛋白质的相对分子质量在16.24～82.04 kDa之间。其中相对分子质量在35.9 kDa左右的7号亚基含量最高,从条带形状和颜色可以看出,该亚基的含量在芡实总蛋白中所占的比例最大(约85%)。

图1 不同芡实样品总蛋白质的SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE graph of total proteins from different varieties of Euryale ferox seed kernels注:图中顶部1～5依次为:刺芡(成熟)、苏芡(成熟)、刺芡(嫩)、苏芡(嫩)和淮芡(嫩)。图中右侧纵列1～12为亚基编号。图2～图4同。

图2 不同芡实样品水溶蛋白的SDS-PAGE图谱Fig.2 SDS-PAGE graph of water soluble proteins from different varieties of Euryale ferox seed kernels

2.2.2 芡实种仁水溶性蛋白质 不同芡实样品中水溶蛋白的SDS-PAGE图谱见图2。在本实验条件下,芡实种仁水溶性蛋白质共分离出两条谱带:29.68 kDa和37.90 kDa,且谱带颜色很浅。说明芡实种仁中水溶性蛋白质含量很少,而且不同品种间、不同成熟度芡实种仁间的差异很大。首先,芡实种仁水溶性蛋白质存在品种间差异:虽然成熟的刺芡和苏芡中都含有这2条亚基,但是刺芡(成熟)中的37.90 kDa亚基含量明显低于苏芡(成熟),而29.68 kDa亚基差异不明显。其次,刺芡(嫩)中只有37.90 kDa亚基,说明29.68 kDa亚基可能是芡实种子后期合成的,也可能是种子在后期成熟中某一高分子量亚基分解产生。而苏芡(嫩)和淮芡(嫩)不含有水溶性蛋白,这2种芡实同属于南芡。该结果表明,南芡种仁中水溶性蛋白的合成可能较晚,可能在种子成熟后期,甚至在种子采收后的贮藏期间。

表3 不同芡实样品中氨基酸的组成(g/100 g)Table 3 The amino acid compositions of different samples of Euryale foerx seed kernels(g/100 g)

注:*表示必需氨基酸;各种风味氨基酸的计算如下:苦味氨基酸:Leu、Ile、Val、Phe、Tyr、Ser、His、Lys和Arg,共9种;甜味氨基酸:Gly、Ala、Thr和Pro,共4种;鲜味氨基酸:Glu、Asp、Ala、Gly、Phe和Tyr,共6种。

2.2.3 芡实种仁醇溶性蛋白质 不同芡实样品醇溶性蛋白质的电泳图谱如图3所示。结果显示,样品1～4中均检出亚基一个,分子量在38.44 kDa左右,而淮芡(嫩)中未检出醇溶性蛋白质。该结果可能有两种解释,淮芡(嫩)中不含有该醇溶性亚基,也有可能是淮芡(嫩)中该醇溶性亚基尚未合成或已经分解,具体的原因还需根据对不同生长期芡实种子的分析来验证。

图3 不同芡实样品醇溶蛋白SDS-PAGE图谱Fig.3 SDS-PAGE graph of gliadinsfrom different varieties of Euryale ferox seed kernels

2.2.4 芡实种仁碱溶性蛋白质 不同芡实样品中碱溶性蛋白质电泳图谱如图4所示。结果显示,碱溶性蛋白质亚基及分子量分布的品种间和成熟度间差异不大。所有样品中均检出2条谱带,分子量为37.97 kDa和21.84 kDa。

图4 不同芡实样品中碱溶蛋白SDS-PAGE图谱Fig.4 SDS-PAGE graph of alkali soluble proteins from different varieties of Euryale ferox seed kernels

2.3 不同芡实样品中蛋白质的氨基酸组成

不同芡实样品中蛋白质的氨基酸组成分析如表3所示。结果显示,在所测定的17种氨基酸中,除脯氨酸外,刺芡(成熟)样品中的各氨基酸含量最高,氨基酸的总含量也最高(8.94 g/100 g),其次是刺芡(嫩),氨基酸总含量最低的是苏芡(嫩),只有7.33 g/100 g,成熟芡实品种氨基酸总量均高于生长期芡实品种,主要原因是其成熟度不够。从风味氨基酸分析结果看,刺芡样品中的甜味氨基酸、鲜味氨基酸和苦味氨基酸含量均高于苏芡。由此说明,芡实种仁经烹饪或加工后,刺芡种仁的风味比苏芡浓些,其主要原因可能是加工中蛋白质发生部分水解,刺芡种仁产生了更丰富的风味氨基酸。此外,有文献报道苏芡的口感比刺芡糯性大,口感好。这是因为苏芡种仁中的支链淀粉含量(48.30%)高于刺芡(38.82%)[27]。从本实验中氨基酸营养效价来看,刺芡要稍优于苏芡。

3 结论

本实验选择3个不同品种、2种不同成熟度的5个芡实种仁样品,对其中的蛋白质亚基结构和氨基酸组成进行了初步分析。结果表明,不同品种的成熟芡实中蛋白质含量差异显著(p≤0.05),刺芡(成熟)显著高于苏芡(成熟)。采用SDS-PAGE法从芡实种仁总蛋白中分离出约20条谱带,不同品种、不同成熟期芡实种仁间无差异性谱带出现。其中分子量35.9 kDa左右的亚基含量最高,是芡实蛋白中最主要的亚基。芡实种仁中水溶性蛋白质含量很少,且不同成熟度芡实种仁间的差异很大。苏芡(嫩)和淮芡(嫩)中未检出水溶性蛋白。不同品种芡实种仁中醇溶性蛋白质亚基组成差异较大,可以作为芡实品种间差异性深入分析的依据。

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The subunit distributions and amino acids analysis of the proteins from different varieties ofEuryaleferoxseed kernels

CHEN Jing1,2,CHEN Zhi-hong2,ZHANG Cuan2,*,BAI Yu2,WANG Mei2

(1.Department of Food and Environmental Engineering,Chuzhou Vocational and Technical College,Chuzhou 239000,China; 2.Heat Sensitive Materials Processing Engineering Technology Research Center,Chuzhou 239000,China)

Five kinds of different varieties and maturityEuryaleferoxseeds samples were selected and their protein subunit structures and amino acid compositions were analyzed in the article. The results showed that the protein content of northernEuryaleferox(mature)seeds was higher markedly than southernEuryaleferox(mature)seeds(p≤0.05),furthermore the essential amino acids、sweet amino acids and umami amino acids contents in northernEuryaleferox(mature)seed proteins were also higher than southernEuryaleferox(mature)seeds,which illustrated that the northernEuryaleferoxwas better than the southernEuryaleferoxin terms of(nutrition and taste. It was resulted that in the SDS-PAGE analysis,twenty bands were separated from the totalEuryaleferoxseeds protein with relative molecular mass between 16.24～82.04 kDa. In addition,the subunit with relative molecular mass at about 35.9 kDa had highest content which was the major subunit in totalEuryaleferoxseeds protein. The contents of water soluble protein were few inEuryaleferoxseeds and there were great differences between different maturites. No water soluble protein was detected in theEuryaleferoxseeds from southernEuryaleferox(not mature)and HuainanEuryaleferox(not mature). The alcohol soluble protein subunit compositions had great diversities among different varieties but no much difference was found in the subunits and molecular weight distribution of alkali-soluble protein from different breeds and ripeness.

Euryaleferoxseed kernel protein;subunit distribution;SDS-PAGE;amino acid analysis

2016-09-19

陈静(1987-)，女，硕士，助教，研究方向：食品分析检测,E-mail：bingxuefeiyan2008@126.com。

*通讯作者:张汆(1970-)，女，博士，教授，研究方向：食品化学与营养学、功能食品研究,E-mail:zhangchuan2005@126.com。

公益性行业(农业)科研专项(201403039)；安徽省热敏性物料加工工程技术研究中心开放基金课题(2015RMY03)；安徽省高校自科重点项目(KJ2016A537)；滁州学院科研项目(2014GH36)。

TS201

A

1002-0306(2017)08-0098-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.011